接種根瘤菌后3個紫花苜蓿品種耐鹽性綜合評價1)

張慧敏 高永 程波 樊璐 通旭芳 萬芳 劉雅婧

(內蒙古農業大學，呼和浩特，010020) (水利部牧區水利科學研究所) (內蒙古農業大學)

全球至少有20%甚至有人估計50%的水澆地受鹽堿影響[1]。隨著中國農業產業結構的調整，牧草作物在畜牧業發展及生態環境治理方面發揮著非常重要的作用[2]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)屬豆科多年生草本植物，是世界上種植最為廣泛的牧草之一，具有產量高、適應性強、營養豐富、草質優良、易于家畜消化等特點，其營養價值居牧草之首，有“牧草之王”的美譽[3]。

土壤鹽害已成為影響植物種子萌發、作物生長和產量的主要非生物脅迫因素[4]。鹽害可導致植物體內超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基積累，大量積累的活性氧引起蛋白質和核酸氧化進而造成細胞損傷[5]。植物則通過提高抗氧化系統酶活性減輕鹽脅迫的傷害[6]。內蒙古地區的半干旱、干旱地區無節制的灌溉，導致土壤的次生鹽漬化問題不斷加重，極大影響牧草的正常生長。

根瘤菌(Rhizobium)是化能異養微生物，是一類在土壤中有廣泛分布的可與豆科植物共生固氮的革蘭氏陰性細菌[7]。紫花苜蓿與根瘤菌的共生固氮提高苜蓿產量，改善品質[8]。根瘤菌與豆科植物的有效共生受到共生體雙方本質及環境的影響和控制[9]。國內外在耐鹽性苜蓿的選育方面已有了較深入的研究，劉春華等通過苗期盆栽脅迫試驗，研究了69個苜蓿品種的耐鹽性。用0.3%和0.4%的鹽處理，存活率分為三級，即21個耐鹽品種，40個中等耐鹽品種和8個敏感品種[9]。關于根瘤菌提高紫花苜蓿耐鹽性的研究已有報道[10-13]。但關于苜蓿中華根瘤菌(RM)能否提高干旱半干旱地區紫花苜蓿品種耐鹽性卻鮮有報道。本試驗從生長和生理方面研究3個紫花苜蓿品種接種RM是否具有抵御鹽害的作用，對其進行耐鹽性綜合評價，以期為干旱、半干旱地區鹽堿土種植的紫花苜蓿增產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與栽培環境

供試種子：供試3個紫花苜蓿(Medicagosativa)品種種子，包括中苜1號、阿爾岡金、金皇后，均來自于內蒙古農業大學沙漠治理學院。所用菌株為耐鹽快生型苜蓿中華根瘤菌，編號為ACCC17537，由中國農業科學院中國農業微生物菌種保藏中心提供。菌株的菌落形態特征、生理生化反應及抗逆性見周冀瓊的研究[12]。

供試土壤：供試土壤取土地位于內蒙古包頭市達茂旗水利部牧區水利研究所，試驗地氣候類型以溫帶半干旱大陸性季風氣候為主，土壤類型以栗鈣土、棕鈣土為主，呈地帶性分布。當地土壤養分差，磷與氮含量低。試驗土壤理化性質為pH值7.8，有機質73.75 g/kg，堿解氮16.20 mg/kg，有效磷7.99 mg/kg，有效鉀338.71 mg/kg。

改良YMA液體培養基：甘露醇10 g、酵母0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.1 g、剛果紅2.5 mL、蒸餾水1 000 mL。

試驗溫室：本試驗于2017年8—10月在內蒙古農業大學的溫室中進行，溫室全天平均溫度為28 ℃，并每天在中午11:30—14:30進行通風降溫處理。

試驗花盆：采用盆栽試驗的圓柱型無孔花盆規格為直徑16 cm，高35 cm。每個花盆裝土8 kg。

1.2 試驗方法

試驗采用隨機區組設計，如表1所示，每6個花盆分為一個區組，共分為9個區組。并設置2個大重復，共108個花盆。

表1 試驗處理

種子處理：選擇成熟、飽滿且大小適中、均勻一致、無病蟲害健康的3個紫花苜蓿品種的種子為試驗材料。先用0.1% K2MnO4表面消毒3 min，再用蒸餾水反復沖洗6次，用濾紙吸干后，每個花盆均勻播種10粒種子，第1次澆灌時注入淡水量為最大持水量(環刀法)[14]，澆完水后進行稱質量。每隔2 d補水(補到最大持水量時花盆的質量)[15]。第8 d間苗，挑選長勢較好的5株繼續培養，拔除剩余幼苗。

根瘤菌接種：在活化并且復壯后的苜蓿中華根瘤菌(RM)中，挑起單菌落，接種在裝有YMA液體培養基的三角瓶中，恒溫震蕩，28 ℃，150 r/min，連續培養，每隔2 h取1次樣，24 h連續取樣，每次取樣均測定OD600nm值[16-17]，繪制生長曲線[13]。然后將菌液稀釋成不同濃度后接種于平板上，置于28 ℃的暗室培養箱培養3 d，隨后計數，確定RM的數量。

將單菌落接種在裝有YMA液體培養基的三角瓶中，恒溫震蕩，28 ℃，150 r/min，培養20 h，用混勻儀混勻菌體，測定OD600nm值[16-17]，對比生長曲線，保證接種時液體中的含菌量大約為每毫升108個細胞。用注射器在每株紫花苜蓿幼苗根部土壤周圍注射1 mL菌液。

試驗設3個鹽濃度處理：0(清水)，50 mmol/L NaCl，150 mmol/L NaCl。紫花苜蓿幼苗長出第3片葉時，對其鹽脅迫處理，為使其逐步適應鹽脅迫環境，每次增加50 mmol/L，分3 d提高至150 mmol/L[18]。

地上鮮質量：鹽脅迫60 d后，將收獲的新鮮植株在靠近莖基部剪去根系，稱量植物地上部分鮮質量。

地下鮮質量：鹽脅迫60 d后，將收獲的新鮮植株在靠近莖基部剪下根系，洗凈并用吸水紙吸干植物地下部分，稱質量。

根瘤數：鹽脅迫60 d后，每個處理隨機選取3株植物，用水仔細沖洗后計算單株總根瘤數和有效根瘤數。

葉片丙二醛(MDA)質量摩爾濃度：鹽脅迫60 d后，將收獲的新鮮植株在靠近莖基部剪去根系，采用硫代巴比妥酸反應法測定[19]。

葉片可溶性糖(SS)質量分數：鹽脅迫60 d后，將收獲的新鮮植株在靠近莖基部剪去根系，采用蒽酮法測定[13]。

1.3 數據分析

用Sigmaplot13.0作圖，用SPSS23.0統計軟件進行數據統計分析。運用Oneway ANOVA進行單因素方差分析，并用Duncan’s檢驗法進行多重比較。利用模糊數學中的隸屬函數法對接種和未接種3個紫花苜蓿品種耐鹽性進行綜合評價[20]。

隸屬函數分析方法：

(1)

(2)

式中：Yij為i品種的j指標的隸屬函數值；Xij為i品種的j指標均值；Xjmax為各品種j指標均值的最大值；Xjmin為各品種j指標均值的最小值。若j指標與耐鹽性呈正相關，用公式(1)；若j指標與耐鹽性呈負相關，用公式(2)[20]。

2 結果與分析

2.1 不同程度鹽脅迫下接種RM對紫花苜蓿地上鮮質量的影響

由表2可知，當沒有鹽害發生時，金皇后的地上部分鮮質量高于其他2個品種，但差異不顯著。當接種RM后，3個紫花苜蓿品種的地上部分鮮質量均增加，且地上部分增產效果顯著。其中，接種RM后金皇后地上部分鮮質量顯著高于阿爾岡金和中苜1號，說明RM對金皇后地上部分增長效果顯著。不同程度鹽害對3個紫花苜蓿品種的地上鮮質量均有抑制作用，且抑制程度隨著鹽濃度的增加而增加。鹽濃度由0到150 mmol/L過程中，與各自對照相比，3個紫花苜蓿品種的地上鮮質量分別下降了16.58 g(中苜1號)、22.56 g(金皇后)、19.74 g(阿爾岡金)，而且在鹽濃度達到150 mmol/L時，3個紫花苜蓿品種地上鮮質量均下降4 g以下，說明鹽害對紫花苜蓿地上鮮質量有極大的影響。但接種RM可有效減小輕度鹽害對3個品種的減產作用，鹽濃度為50 mmol/L時，接種RM 3個紫花苜蓿品種的地上鮮質量相比于各自不接種的地上鮮質量，均有顯著性提高。鹽濃度150 mmol/L時，雖然3個紫花苜蓿品種接種RM后地上鮮質量依然高于不接種，但不再是顯著性提高，說明在3個紫花苜蓿品種遭遇低鹽害時，接種RM可有效緩解鹽害對于植物地上部分鮮質量的影響，隨著鹽害程度加強，這種緩解鹽害的作用也在逐漸減弱。

表2 NaCl脅迫下RM對紫花苜蓿地上部分鮮質量的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

2.2 不同程度鹽脅迫下接種RM對3個紫花苜蓿品種根鮮質量的影響

由表3可知，當不發生鹽害時，未接種RM的金皇后根鮮質量高于阿爾岡金和中苜1號，但差異不顯著。而接種RM后3個品種根鮮質量均顯著高于未接種，且金皇后根鮮質量顯著高于阿爾岡金和中苜1號。不同程度鹽害對3個品種的紫花苜蓿根鮮質量均有抑制作用，且隨鹽濃度升高明顯增加，鹽濃度由0至150 mmol/L，3個品種分別減少3.31 g(中苜1號)、3.62 g(金皇后)和3.33 g(阿爾岡金)，說明鹽害對紫花苜蓿根鮮質量產生不利影響。當鹽濃度為50 mmol/L時，3個品種的紫花苜蓿接種RM后根鮮質量仍分別顯著高于未接種1.03 g(中苜1號)、1.51 g(金皇后)和2.14 g(阿爾岡金)。但當鹽濃度為150 mmol/L時，是否接種RM對3個品種的紫花苜蓿根鮮質量沒有影響，說明隨鹽濃度的升高，RM對3個紫花苜蓿品種根鮮質量的作用逐漸減弱。

2.3 不同程度鹽脅迫下接種RM對3個紫花苜蓿品種根瘤數的影響

由表4可知，土壤中不含RM且不接種RM的紫花苜蓿不產生根瘤。當不發生鹽害時，金皇后產生的根瘤數最多，且金皇后和中苜1號產生的根瘤數顯著高于阿爾岡金。隨鹽濃度升高，接種RM后的3個品種的紫花苜蓿根瘤數明顯減少。隨著鹽濃度由0 mmol/L增加至150 mmol/L，中苜1號、金皇后和阿爾岡金根瘤數分別減少12.33個、17個和7.34個，說明鹽害對接種RM的紫花苜蓿根瘤的形成產生很大的抑制作用。當鹽濃度為50 mmol/L時，中苜1號和金皇后產生的根瘤數仍顯著高于阿爾岡金。當鹽害水平增加至150 mmol/L時，中苜1號和阿爾岡金的根瘤數卻顯著高于金皇后，說明隨著鹽害水平的升高，對RM作用于3個紫花苜蓿品種的效果均有減弱，其中，RM作用對于金皇后的抑制效果最為明顯。

表3 NaCl脅迫下RM對紫花苜蓿根鮮質量的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

表4 NaCl脅迫下RM對紫花苜蓿根瘤數的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

2.4 不同程度鹽脅迫下接種RM對3個紫花苜蓿品種有效根瘤數的影響

由表5可知，土壤中不含RM且不接種RM的紫花苜蓿有效根瘤數為0。在鹽害不發生時，金皇后(16個)和中苜1號的有效根瘤數顯著高于阿爾岡金。當鹽害達到50 mmol/L時，金皇后的有效根瘤數顯著高于中苜1號和阿爾岡金，說明RM對金皇后這一紫花苜蓿品種產生有效根瘤數的作用效果最好。不同程度鹽脅迫對紫花苜蓿有效根瘤數產生抑制作用。隨著鹽濃度上升，3個品種紫花苜蓿的有效根瘤數均有下降，尤其是在150 mmol/L鹽濃度時，有效根瘤數都下降至0，說明鹽害程度越高，RM對紫花苜蓿浸染所產生的有效根瘤數越少，鹽害對RM的作用效果產生極大抑制。

表5 NaCl脅迫下RM對紫花苜蓿有效根瘤數的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

2.5 不同程度鹽脅迫下接種RM對3個紫花苜蓿品種丙二醛(MDA)質量摩爾濃度的影響

由表6可知，在鹽害不發生時，接種RM后中苜一號和阿爾岡金MDA質量摩爾濃度分別顯著減少0.17和0.28 mmol/g，金皇后MDA質量摩爾濃度減少0.11 mmol/g，說明在非鹽脅迫下，接種RM對3個紫花苜蓿品種的膜脂過氧化程度產生抑制。在鹽濃度為50 mmol/L時，接種RM的金皇后MDA質量摩爾濃度顯著減少0.57 mmol/g，中苜1號和阿爾岡金MDA質量摩爾濃度分別減少0.15和0.21 mmol/g，說明在輕度鹽害時，接種RM緩解紫花苜蓿的膜脂過氧化程度。當鹽濃度升高至150 mmol/L時，接種RM對3個紫花苜蓿品種的MDA質量摩爾濃度影響不大，RM對紫花苜蓿的作用極小。隨著鹽濃度升高，紫花苜蓿MDA質量摩爾濃度明顯增加，中苜一號、金皇后和阿爾岡金的MDA質量摩爾濃度分別增加了1.68、2.03和1.04m mmol/g，說明隨著鹽害程度加重，RM對3個品種的紫花苜蓿膜脂過氧化程度的緩解作用逐漸減弱。

2.6 不同程度鹽脅迫下接種RM對3個紫花苜蓿品種葉片可溶性糖質量分數的影響

由表7可知，無論鹽害是否發生，接種RM總體上對3個紫花苜蓿品種葉片可溶性糖質量分數稍有提升，但差異不顯著，說明接種是否RM對紫花苜蓿葉片可溶性糖的產生影響不顯著。當鹽害未發生時，接種RM紫花苜蓿葉片可溶性糖質量分數分別為8.97 mg/g(中苜一號)、12.17 mg/g(金皇后)和7.41 mg/g(阿爾岡金)。但當鹽濃度上升至50 mmol/L時，3個紫花苜蓿品種葉片可溶性糖質量分數分別為14.62 mg/g(中苜一號)、21.65 mg/g(金皇后)和15.58 mg/g(阿爾岡金)，明顯增加了5.65、16.16和8.17 mg/g，說明輕度鹽脅迫促進紫花苜蓿葉片可溶性糖的產生。而當鹽害程度由50 mmol/L上升到150 mmol/L時，3個紫花苜蓿品種葉片可溶性糖質量分數分別下降至12.21 mg/g(中苜一號)、16.36 mg/g(金皇后)和11.76 mg/g(阿爾岡金)，說明當重度鹽害發生時，紫花苜蓿葉片可溶性糖質量分數開始下降，隨著鹽害程度的增加逐漸抑制可溶性糖的產生。

表6 NaCl脅迫下RM對紫花苜蓿MDA質量摩爾濃度的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

表7 NaCl脅迫下RM對紫花苜?？扇苄蕴琴|量分數的影響

注：表中數據為平均值±標準差；同列不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

2.7 3個紫花苜蓿品種耐鹽性綜合評價

由表8可知，因為當鹽濃度為150 mmol/L時，對3個紫花苜蓿品種重度脅迫，是否接種RM對其耐鹽性影響不明顯，只計算鹽濃度為50 mmol/L時紫花苜蓿隸屬函數值(表8)。計算紫花苜蓿地上部分鮮質量、根鮮質量、根瘤數、有效根瘤數、丙二醛質量摩爾濃度和可溶性糖質量分數6個指標相對值的耐鹽隸屬函數值，進行耐鹽性綜合評價。通過隸屬函數法分別計算3個紫花苜蓿品種未接種和接種RM的隸屬度平均值分別為0.3，0.29，0，0.64，0.98，0.5，排序耐鹽性強弱依次為金皇后(接種RM)、中苜1號(接種RM)、阿爾岡金(接種RM)、中苜1號(未接種RM)、金皇后(未接種RM)、阿爾岡金(未接種RM)。

表8 3個紫花苜蓿品種接種和未接種耐鹽指標隸屬函數值及耐鹽性綜合評價

3 討論

3.1 接種根瘤菌對地上部分鮮質量與根鮮質量的影響

在已知牧草耐鹽性評價中，紫花苜蓿屬于中等水平[21]。鹽脅迫對植物生長的影響與鹽分濃度和植物本身的耐鹽程度有關[22]。植物在鹽脅迫下，最先受到脅迫傷害的是根系，繼而再發生一系列的生理生化反應，影響地上部分的生長發育，其中相對生長量是植物對鹽脅迫的綜合表現[23]。根的生長狀況是衡量鹽害對植物生長影響的重要指標。王建科研究表明，不同鹽分對幼根的生長都有抑制作用[22]。牛遠研究結果表明，大豆鮮生物量、根鮮質量在遭受鹽害時變化顯著[24]。謝委對紫花苜蓿的研究表明，NaCl處理濃度越高，其根長和苗長越受抑制[25]。本研究中，不同鹽害程度對3個紫花苜蓿品種的生長均有抑制作用。隨著NaCl濃度的提高，3個紫花苜蓿品種地上部分和根鮮質量明顯減少。在輕度鹽脅迫下，金皇后地上部分和根鮮質量明顯優于中苜一號和阿爾岡金，說明金皇后自身耐鹽性優于其他2個紫花苜蓿品種。而重度鹽害環境下3個紫花苜蓿品種的地上鮮質量和根鮮質量微小且彼此間差異不明顯，說明重度鹽害時，3個紫花苜蓿品種自身調節作用不足以調節外部的惡劣環境。

3.2 接種根瘤菌對根瘤數與有效根瘤數的影響

前人研究表明，接種叢枝菌根真菌(AM)、苜蓿中華根瘤菌(RM)等可以提高鹽害環境下的紫花苜蓿產量[26-30]。根瘤菌生活在植物組織內部，通過長期的自然選擇與宿主植物共生，在抵御外界環境脅迫方面比其他根際微生物具有更強的生存優勢[31]。張攀等發現根瘤菌侵染過程能促使植物產生應激防御，并形成免疫機制，以提升紫花苜蓿在遭受鹽脅迫時的耐受能力，從而提高其耐鹽性[32]。Ensiye Ashrafi等發現無論是否在鹽害環境中，混合接種AM和RM均能通過提高定植、結瘤數和養分吸收來提高紫花苜蓿產量[33]。宋婷婷對根瘤菌共生紫花苜蓿研究表明，接種根瘤菌可減緩鹽脅迫對作物根的傷害[34]。石茂玲對紫花苜蓿接種根瘤菌的研究表明，與根瘤菌共生可大幅提高紫花苜蓿單株總根瘤數和單株有效根瘤數[35]。根瘤是在植物根系上生長的特殊的瘤，因寄生組織中建成共生的固氮細菌而形成，合成自身的含氮化合物。根瘤包括有效根瘤和無效根瘤，而其中真正發揮作用的是有效根瘤。本試驗中，土壤不存在RM且不進行人工接種RM的情況下，紫花苜蓿不產生根瘤。3個紫花苜蓿品種在接種RM后產生根瘤，且隨著鹽害程度的提升，根瘤和有效根瘤的產生受到抑制。

3.3 接種根瘤菌對丙二醛含量與可溶性糖質量分數的影響

植物通過生理代謝增強對鹽脅迫的適應能力，即合成滲透調節物質，通過生物膜保護系統清除活性氧，鹽分區隔化[36]。本試驗選用兩個典型逆境生理指標反映3個紫花苜蓿品種受到鹽脅迫時的響應。MDA作為脂質過氧化作用的產物，其含量的高低可以代表膜損傷程度的大小[37]。而可溶性糖能夠維持細胞膜結構的完整性，在植物生命周期中起關鍵作用[38]。植物在遭遇鹽害時，就會積累大量的滲透保護劑，例如可溶性糖[39]。李莎莎對其他非生物脅迫影響根瘤菌共生紫花苜蓿的研究表明，低溫脅迫下，接種RM后MDA質量摩爾濃度低于不接種的紫花苜蓿，且葉片可溶性糖質量分數高于不接種的紫花苜蓿[40]。張攀對干旱脅迫影響根瘤菌共生紫花苜蓿研究表明，接種RM的紫花苜蓿葉片可溶性糖質量分數明顯高于不接種[41]。本試驗中，3個紫花苜蓿品種葉片MDA質量摩爾濃度隨鹽濃度升高而增加，說明膜脂過氧化程度加劇。在輕微鹽脅迫下接種RM，MDA質量摩爾濃度相對于未接種下降，但在重度鹽害條件下，接種RM對MDA質量摩爾濃度變化影響微弱，說明輕微鹽脅迫下接種RM提高紫花苜蓿對活性氧的防御能力，但重度鹽脅迫對RM的作用產生很大抑制。在本試驗中隨鹽脅迫加重，可溶性糖質量分數先升高后降低，說明滲透調節系統功能性先增強后減弱。在相同鹽害水平下，接種RM對紫花苜蓿葉片可溶性糖質量分數稍有提升，說明輕度鹽脅迫下，接種RM可提高紫花苜蓿的滲透調節能力，但重度鹽害會抑制RM的作用。

3.4 3個紫花苜蓿品種接種或未接種RM耐鹽性綜合評價

紫花苜蓿耐鹽性表現是一個復雜的過程，其耐鹽能力強弱是多種代謝的綜合體現[42]。用單項指標對材料間耐鹽性評價尚有局限，因此采用綜合評價法[43]。植物耐鹽性評價包括直接測定和間接測定。直接測定包括植株生物量、生長速率等，間接測定包括水分吸收、MDA質量摩爾濃度和抗氧化物質等[44]。熊雪等用NaCl模擬鹽脅迫，采用隸屬函數法對生長速率、地上生物量、地下生物量、丙二醛含量等指標相對值對不同紫花苜蓿品種進行耐鹽性綜合評價[20]。李源等用MDA質量摩爾濃度、可溶性糖質量分數和細胞質膜透性等指標對18個紫花苜蓿品種進行耐鹽評價[43]。本研究利用模糊數學中的隸屬函數法，選擇地上部分鮮質量、根鮮質量、根瘤數、有效根瘤數、MDA質量摩爾濃度與可溶性糖質量分數這6個指標的相對值對3個紫花苜蓿品種接種或未接種RM進行耐鹽性綜合評價，得到耐鹽性強弱依次為金皇后(接種RM)、中苜1號(接種RM)、阿爾岡金(接種RM)、中苜1號(未接種RM)、金皇后(未接種RM)、阿爾岡金(未接種RM)?？傮w來看，在鹽害環境下，接種RM最宜種植紫花苜蓿品種為金皇后，其次為中苜一號。本研究為今后內蒙古鹽漬土地區選育紫花苜蓿品種提供參考。

4 結論

紫花苜蓿產量隨鹽害程度的升高而降低，當輕度鹽害發生時，接種苜蓿中華根瘤菌可提高紫花苜蓿的耐鹽性。當重度鹽害發生時，接種苜蓿中華根瘤菌對紫花苜蓿的耐鹽性幾乎無影響。當未發生鹽害或輕度鹽害發生時，金皇后品種耐鹽性最強，當重度鹽害發生時，3個紫花苜蓿品種耐鹽性均弱。