利瑪原甲藻PL11共附生菌多樣性研究

李月月，田曉清，韓清華，樊成奇，馬麗艷，陸亞男

（1.上海海洋大學，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；3.農業農村部東海漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090）

原甲藻（Prorocentrum）是導致赤潮的重要生物之一，其代表產物大田軟海綿酸（okadaic acid，OA）及其結構類似物鰭藻毒素-1（dinophysistoxin-1，DTX-1）是腹瀉性貝類毒素（diarrheic shellfish poisoning，DSP）的主要組分。腹瀉性貝類毒素引起的中毒事件具有全球性，自20世紀60年代以來在歐洲、亞洲、北美洲、南非等地都曾有報道［1］，DSP不僅會危害海洋生態平衡，還會通過海洋食物鏈的富集威脅人類健康［2］，同時也是蛋白磷酸酶2A、1和2B的有效抑制劑，可以導致人體消化系統中癌癥的發生［3］。而利瑪原甲藻（P.lima）是原甲藻屬甲藻中主要的產毒藻株，可以作為腹瀉性貝毒的穩定性來源，因此利瑪原甲藻在很長一段時間內一直是人們研究的熱點。然而直到目前，對于利瑪原甲藻產毒機制方面的研究仍較少。事實上，利瑪原甲藻中生物毒素的表達水平受營養和環境因素的影響很大［4］，但是包括環境微生物在內的各種因素對其產毒的具體影響仍未有定論。雖然目前認為利瑪原甲藻相關細菌并不能獨立產生毒素［5］，但是很多學者認為其對藻毒素的產生有著直接或間接的影響［6］。有研究表明，細菌可能對利瑪原甲藻細胞產生毒素有一定的協同作用，在利瑪原甲藻的衰老階段，產毒水平增加，這些細菌可能開始降解利瑪原甲藻細胞，會加速微藻的衰老，裂解作用可能會增加溶解有機碳的數量，這可能為增加毒素的產生提供更多的資源，從而促進毒素的生成［1］。目前，關于細菌對利瑪原甲藻產毒的影響只進行了初步的探索，它們之間的相互作用機制仍然需要更深入的研究。

本文以利瑪原甲藻藻株為研究材料，通過高通量測序及微生物純培養技術，對利瑪原甲藻PL11可能的共附生菌群的多樣性進行分析，包括其群落的組成以及相對豐度。并通過純培養的方法得到9株可培養細菌，以期為后期繼續研究細菌在微藻產毒過程中的作用提供必要的生物材料及基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生物材料：利瑪原甲藻PL11。

試劑材料：Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物有限公司）；16s引物（上海生工生物有限公司）；PCR擴增體系（康為世紀）；PBS緩沖液（上海生工生物有限公司）。

培養基：f/2培養基，2216E培養基。

實驗儀器：高壓滅菌鍋：股海申安醫療器械廠，LDZX-75KBS型；大型恒溫培養箱：上?；瘜W儀器有限公司，ATB-032型；超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器有限公司，DL-CJ-INDII型；臺式高速離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司，H-1560型；超聲儀：上海漢克科學儀器有限公司，SK250LH型；PCR儀：杭州朗基科學儀器有限公司，AG-22331型；凝膠成像系統：上海天能科技有限公司，GIS-1600型。超純水儀：上海智巖科學儀器有限公司，Milli-QAdvantage型。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻培養

利瑪原甲藻采用f/2培養基進行培養。f/2培養基由4種儲備液配制而成，分別為75.0 g·L-1NaNO3溶液、5.0 g·L-1NaH2PO4·H2O溶液、L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution。其中 NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O、L1 Trace Metal Solution以超純水配制后，高溫滅菌放入4℃冰箱內儲存備用；Vitamin Solution以高溫滅菌后的超純水配制備用。L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution為混合溶液，具體配方見表1。

f/2培養基配制過程如下：將超純水用鹽鹵將其鹽度調至23，分別加入1 mL NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O溶液以及L1 Trace Metal Solution，高壓滅菌鍋高溫滅菌30 min（120℃），冷卻至20℃加入0.5 mL Vitamin Solution。利瑪原甲藻的培養條件：光照強度為4 500～5 000 lx，光照周期為12L/12D，溫度為24℃。

表1 f/2培養基配方Tab.1 Medium formula of f/2

1.2.2 高通量測序及數據分析

實驗室培養藻的密度達到1×106個·L-1后，取50 mL藻液于無菌離心管中，離心（轉速6 000 r·min-1，時間 5min），收集藻細胞，以 30 mL pH 7.2的PBS緩沖液洗滌藻細胞，重復4次放置備用。藻共附生菌總基因組DNA以Stool DNA Kit試劑盒（美國OMEGA）提取，取1mL以擴增引物338F和806R進行擴增。上游引物為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物 為 806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′［7］。PCR擴增反應體系如下：模板 DNA：10 ng，BSA：0.2μL，DNA多聚酶：0.4μL，5×FastPfu緩沖液：4μL，2.5 mmol·L-1dNTPs：2μL，上游引物（5μmol·L-1）：0.8μL，下游引物（5μmol·L-1）：0.8μL，加入滅菌后的超純水使總體積達到50μL。PCR反應條件：預變性時間5 min（95℃），進入循環，變性時間40 s（95℃），退火時間40 s（55℃），延伸時間60 s（72℃），循環30次，最后延伸15 min（72℃）。通過電泳來檢驗PCR完成的產物是否合格，如條帶清晰，無降解則符合后續測序要求。如條帶不清晰或未出現，則重新進行PCR擴增，若再次擴增后仍沒出現清晰的條帶則要重新提取?；厥誔CR產物樣品進行Illumina Miseq高通量測序（上海美吉生物公司）。

數據質控：根據paired-end reads之間的互相重疊進行序列拼接，對reads的質量和拼接的效果進行質控分析［8］，具體操作如下：以 FLASH對每個樣品的讀長進行拼接，得到原始連接數據（raw tags），對原始連接數據進行進一步的過濾以得到高質量的連接數據（clean tags）；后續進行tags截取，截取質量閾值為≤19，堿基數默認長度為3，得到tags數據集，過濾掉連續高質量堿基長度小于tags長度75% 的 tags。最后進行去除嵌合體序列的處理，通過與數據庫的比對，移除掉Chimera序列，得到有效數據（effective tags）［9］。

數據分析：按照序列間的距離進行聚類分析，從中選取與代表序列相似度大于97%的序列生成操作分類單元（OTU）。選取Silva作為細菌16SrRNA數據庫、RDP、Greengene為功能基因數據庫，使用Qiime平臺與 RDP Classifier分別作為計算軟件及算法，設定0.7為置信度閾值［10］。菌落豐富度（community richness）指數分別為Chao和ACE；菌落多樣性（community diversity）指數為Shannon以及 Simpson。稀釋曲線（rarefaction curve）采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們對應的物種（如OTU）數目或多樣性指數來構建。

1.2.3 可培養共附生菌株的分離及鑒定

取1.5 mL藻液（對數生長期）于2 mL的EP管中，離心（轉速 6 000 r·min-1，5 min）。棄去上清液，加入1.5 mL無菌超純水輕輕震蕩混勻，重復離心一次，棄上清液加入1.5 mL無菌超純水震蕩混勻，冰浴下超聲波破碎藻細胞處理10 min，然后用滅菌超純水將其稀釋10倍，分別取200μL破碎藻細胞原液與稀釋后的藻液均勻的涂布在2216E平板培養基上，28℃培養48 h，期間不斷進行觀察，待培養基上生長出單菌落后，在2216E平板培養基上再次進行劃線純化，徹底純化后的單菌落接種到固體斜面培養基上，28℃培養48 h后接種到2216E液體培養基中并放入搖床中培養48 h（23℃）［10-11］。

16S rRNA測序及比對：使用細菌基因組DNA提取試劑盒（日本 TaKaRa）提取基因組DNA，按照試劑盒的說明書進行具體實驗步驟：取1 mL菌液至1.5 mL無菌離心管中，離心（轉速8 000 r·min-1，時間 1 min），棄上清收集菌體。加入180μL溶菌酶溶液重懸菌液，37℃水浴30～60 min，再加入400μL Buffer Digestion，震蕩混勻，65℃水浴1 h。加入200μL Buffer PB，充分混勻，-20℃放置5 min后離心（轉速10 000 r·min-1，時間5 min），將上清液轉移至新的離心管中。加入1 mL異丙醇，充分混勻后離心（轉速10 000 r·min-1，時間 5 min），棄上清。加入 1 mL 75%乙醇，離心（轉速10 000 r·min-1，時間2 min），棄上清。打開離心管的蓋子倒置5～10 min使乙醇完全揮發，得到所需DNA。加入50 μL TE Buffer溶解DNA，以16S rRNA擴增通用引物27F及1492R進行擴增，其序列分別為上游引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系包括：23μL的 2×TaqPCR MasterMix：，1μL上游引物，1μL下游引物，5μL模板DNA，20μL去離子水［10］。PCR擴增程序如下：預變性時間4 min（95℃），進入循環，變性時間40 s（95℃），退火時間40 s（57℃），延伸時間2 min（72℃），循環 40次，最后延伸 10 min（72℃）。PCR擴增結束后進行電泳?；厥諛悠愤M行基因測序（上海美吉生物公司），對獲得的16SrRNA基因序列進行分析，通過EzBioCloud進行菌株序列同源性對比，建立菌株的16S rRNA基因系統發育進化樹（MEGA軟件）［7］。

2 結果與分析

2.1 樣品信息統計

利瑪原甲藻PL11共附生微生物的測序結果如表2所示，通過高通量測序一共獲得42 065條序列。稀釋曲線（rarefaction curve）可以用來比較測序樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理［12］。以Shannon為多樣性指數構建稀釋曲線（圖1），樣品的曲線逐漸趨向水平，說明測序數據量已經足夠大，可以反映樣品中的物種多樣性，樣本的測序數量是合理的。

表2 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測序樣本信息表Tab.2 Summary of the high-throughput sequencing sample from P.lima PL11

圖1 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測序樣品Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of the sequencing sample from P.lima PL11

2.2 利瑪原甲藻的共附生菌多樣性分析

MiSeq高通量測序結果顯示，利瑪原甲藻PL11共附生菌群共68個OTU，包括5門，14綱，26目，38科及54屬。PL11共附生菌群屬水平相對豐度分布如圖2所示。其中優勢門（＞5%）3個，包括變形菌門（Proteobacteria，75.5%）、擬桿菌門（Bacteriodetes，11.5%）以及浮霉菌門（Planctomycetex，8.5%）。優勢綱（＞5%）4個，包括 α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，51.7%）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，31.8%）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteria，9.9%）以及 OM190綱（8.9%）；優勢屬（＞5%）6個，包括侏囊菌科下未 知 屬 （norank Nannocystaceae，21.8%）、Pyruvatibacter屬（11.6%）、Phaeodactylibacter屬（9.4%）、生絲單胞菌科下未知屬（norank Hyphomonadaceae，8.5%）、OM190綱下未知屬（8.1%）以及Roseovarius屬（7.9%）。用MEGA6建立的利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統發育進化樹見圖3。

2.3 利瑪原甲藻可培養共附生菌的系統發育進化分析

從利瑪原甲藻PL11培養物中分離出了9株細菌，用MEGA6建立的系統發育進化樹見圖4，通過序列同源性比對（表3）以及系統發育進化樹的結果顯示，這些菌株分屬于8個屬，如表3所示，分 別 為Ochrobactrumsp.（2株）及Microbacteriumsp.、Algoriphagussp.、Ponticoccussp.、Hoefleasp.、Labrenziasp.、Erythrobactersp.、Sphingopyxissp.各1株。其中，菌株PL11-1與已知菌株的16S rRNA基因同源性最高值為97.55%，說明其為Ponticoccus屬潛在新種，其多相分類學鑒定分析目前正在進行中。

3 討論

圖3 利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial community associated with P.lima PL11

表3 菌株種屬的分類結果Tab.3 Classification results of strain species

圖4 基于16Sr RNA序列構建的可培養共附生菌的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis of 16S r RNA sequences

細菌和浮游植物之間的相互作用越來越多地被認為是毒素產生和赤潮發生的重要因素［13］，了解毒素的產生機制有利用解決其對環境以及人類健康產生的危害，藻菌之間的相互作用關系是了解毒素產生的關鍵環節。高通量測序技術不經過分離培養微生物就可以分析微生物群落的多樣性，從而為優化利瑪原甲藻共附生微生物的分離并增加其可培養性帶來有價值的參考。本文利用MiSeq高通量測序首次對利瑪原甲藻PL11共附生菌群多樣性進行了分析。從獲得的68個OTU中歸類出54個屬，其優勢屬6個。先前電子顯微鏡觀察研究表明，在無菌培養的利瑪原甲藻細胞中沒有檢測到細菌。通過高通量測序可以清楚的看到利瑪原甲藻PL11具有豐富且多樣的微生物群落。

此外，基于微生物純培養技術從利瑪原甲藻PL11中分離獲得9株細菌，包括一株潛在新株PL11-1。PL11-1屬于玫瑰桿菌簇，紅桿菌科，Ponticoccus屬；Poncticoccussp.與藻類赤潮爆發關系密切，TAN等［14］等發現Ponticoccus屬下一株菌在發生赤潮時能與藻類相互作用，表現出一定的主導作用。Ponticoccussp.PD-2是首次發現的有群體感應的菌株，它對多種赤潮藻的生長都能產生抑制作用［15］。從利瑪原甲藻PL11中得到的PL11-1可能與利瑪原甲藻生長和產毒都有著密切的關系。fan3-1屬于鞘氨醇單胞菌（Sphingopyxissp.），鞘氨醇單胞菌可以降解微囊藻毒素，通常情況下同一株菌只能降解一種藻毒素，Sphingopyxis屬下一株菌卻能夠同時降解 MCYR、MC-LR和 MC-RR 3種毒素［16］。進一步研究Ponticoccus屬下PL11-1與Sphingopyxis屬下fan3-1和利瑪原甲藻之間的相互作用關系，可以更好地了解利瑪原甲藻產毒或毒素降解的機理。關于利瑪原甲藻與其共附生微生物的相互作用，本團隊其他成員正在利用獲得的菌株開展試驗研究。

通過高通量測序技術首次解析了利瑪原甲藻PL11共附生微生物種類、豐度及多樣性信息，還通過分離純化獲得了純培養的PL11共附生細菌9株，對比發現純培養獲得的菌株種屬與高通量測序中相對豐度較高的種屬一致性不高，可能是菌株分離時的培養基、溫度等因素以及微生物自身的可培養性造成的影響。此結果對于深化對利瑪原甲藻共附生微生物多樣性的認識，指導其可培養共附生微生物的分離具有重要意義。