耐鹽酵母菌對鱈魚骨酶解液風味的改善作用

朱文慧 胡顯杰 步 營* 李學鵬 徐永霞 沈 琳 牟偉麗 勵建榮

（1 渤海大學食品科學與工程學院遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心” 遼寧錦州121013 2 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116000 3 蓬萊京魯漁業有限公司 山東蓬萊265600）

鱈魚（Pollock）俗稱明太魚，是全世界年捕撈量最大的魚類之一。鱈魚在加工生產過程中會產生大量的廢棄物，其中魚骨占鱈魚整體質量的15%[1-2]。我國水產品加工率不到30%，遠遠低于發達國家（＞80%），對下腳料的利用更少，多數企業將其作為固體廢棄物處理，造成了資源浪費和環境污染[3]。水產品普遍存在腥味等不良風味，水產酶解液通常亦具有苦腥味，苦腥味的存在已成為水產酶解液在食品行業應用的主要限制因素[4]。目前，酵母發酵法常被用于水產品的脫腥、脫苦。付湘晉等[5]發現酵母發酵脫腥的機理之一是把醛類、醇類轉化成相應的酸。耐鹽酵母常被用于改善醬油的風味物質，在水產脫腥、脫苦方面還未見報道。

針對水產酶解液中存在的苦腥味問題，本文以鱈魚骨酶解液為對象，利用耐鹽酵母對其進行脫腥苦的研究，旨在創新和豐富水產調味料的基礎理論，為魚骨酶解液后續的加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚骨，大連天寶綠色食品股份有限公司；食鹽、葡萄糖均為食品級，購于錦州市萬維超市；AP-2002 堿性蛋白酶、FF104 中性蛋白酶、耐鹽酵母為魯氏結合酵母 （Zygosaccharomyces rouxii，Z.rouxii），安琪酵母股份有限公司；甲醛，分析純，天津市天力化學試劑有限公司；氫氧化鈉（標準滴定溶液），天津市光復精細化工研究所。

1.2 設備與儀器

LY-380D 隆粵商用多功能破壁料理機，中山市隆粵電器廠；HH-4 數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Biofugestratos 臺式冷凍高速離心機，美國Thermo Fisher 公司；DL-1 萬用電爐，北京中興偉業儀器有限公司；LRH-150 生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；PEN 3 便攜式電子鼻 （傳感器陣列由10 個金屬氧化物傳感器組成），德國Airsense 公司；Orion Star 系列手持式便攜pH 計，Thermo 公 司；Agilent 7890N-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent 公司；固相微萃取裝置、固相微萃取手柄、20 mL 頂空樣品瓶，美國SUPELCO；全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 鱈魚骨酶解液的制備

將魚骨化凍，清洗，以料液比1 ∶1 的添加量，放入破碎機，打碎。置于85 ℃水浴鍋中滅菌10 min 冷卻。后加入魚骨質量0.3%的堿性蛋白酶和0.1%的風味蛋白酶，在55 ℃條件下，攪拌酶解3 h后置于95 ℃的水浴鍋中滅酶15 min。過濾離心，取上清液，冷藏待用。

1.4 耐鹽酵母發酵脫苦腥條件的確定

分別按酶解液質量分數的0.1%和2%添加耐鹽酵母和葡萄糖。酵母在加入酶解液前，需先用酶解液質量10%，35～40 ℃的水活化5～10 min。

1.4.1 單因素試驗 取一定量的魚骨酶解液，選取時間、溫度、加鹽量這3 個因素進行單因素試驗，測定電子鼻，并進行感官評定。

1.4.1.1 發酵時間單因素試驗 添加酶解液質量10%的食用鹽。在35 ℃下分別發酵6，12，18，24 h，以未添加酵母的酶解液作對照。

1.4.1.2 發酵溫度單因素試驗 添加酶解液質量10%的食用鹽。分別在30，35，40，45 ℃下發酵12 h，以未添加酵母的酶解液作對照。

1.4.1.3 加鹽量單因素試驗 分別添加酶解液質量5%，10%，15%，20%的食用鹽。在40 ℃下發酵12 h，以未添加酵母的酶解液作對照。

1.4.2 正交試驗的設計 在單因素試驗基礎上進行L9（33）正交試驗，因素水平設計見表1，通過氨基酸態氮含量測定，選擇最優水平組合。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.5 測定方法

1.5.1 氨基酸態氮、總酸和氨基酸的測定 采用甲醛滴定法，參考王琳等[6]的方法進行氨基酸態氮的測定；參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》中的酸堿中和滴定法[7]進行總酸的測定；采用氨基酸自動分析儀進行氨基酸的測定。

1.5.2 電子鼻分析 根據樣品頂空揮發物通過傳感器的電阻值G 與基準氣體通過傳感器的電阻值G0的比值而進行數據處理和模式識別[8]。傳感器由10 種金屬氧化物半導體型（Metal oxide semiconductor，MOS）化學傳感元件組成，每型傳感元件對應的主要敏感物質見表2。

表2 化學傳感器及其對應的敏感物質類型Table 2 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

用50 mL 的燒杯，稱量5 g 左右的待測樣品，并用保鮮膜封口。25 ℃環境中運用電子鼻傳感器對樣品進行檢測。檢測時間120 s，進樣流量和內部流量均為300 mL/min，數據采集時間為90 s 和95 s[9]。

1.5.3 感官評定 發酵脫腥液的風味能綜合反映產品的感官質量，絕大多數消費者認為發酵脫腥液的腥味、苦味、澀味、咸味決定著香氣和滋味，因此本試驗選擇這4 個指標作為評定對象，采用5級標度法和發酵脫腥液的質量等級評定標準 （表3）進行感官評價。參加品評的人員由20 位食品專業品評師組成，按照標準，分別對發酵脫腥液的各項指標進行等級評定并打分，記錄評定結果[10-13]。

表3 酶解液感官質量評定標準Table 3 Evaluation criteria of sensory quality of enzymatic hydrolysate

1.5.4 氣相色譜-質譜條件 參考文獻[3，14-17]并適當改進如下：量取5 mL 待測液，裝入固相微萃取小瓶，加入轉子，密封，45 ℃水浴平衡10 min，然后將固相微萃取針頭插入小瓶中，推動手柄使纖維頭處于頂空狀態，吸附30 min，進樣。

色譜條件：Agilent 7890N 氣相色譜儀，HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；不分流模式進樣；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 的速率上升至120 ℃再以升溫速率5 ℃/min 上升至230 ℃，保持5 min。

質譜條件：電離方式為電子轟擊（EI 源），電子能量70 eV；色譜-質譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍30～550（m/z）。

1.5.5 數據分析 使用軟件SPSS 19.0 進行正交試驗數據分析，Origin 9.1 作圖；電子鼻數據處理：每個處理進行3 次重復，結果利用電子鼻自帶軟件對測試結果進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）；GC-MS 數據處理：樣品中的揮發性成分經氣相色譜分離，用質譜進行分析鑒定。分析結果利用計算機譜庫（Nist/Wiley）進行初步檢索及定性分析。

2 結果分析

2.1 發酵時間對脫腥苦效果的影響

不同發酵時間下發酵脫腥液PCA 分析和感官評價結果如圖1和圖2所示。由圖1可知，不同發酵時間下樣品第1 主成分 （PC1）的貢獻率為82.06%，第2 主成分（PC2）的貢獻率為15.30%，總貢獻率為97.36%，大于95%，說明所受干擾很小。由圖可知，12 h 的發酵脫腥液第一主成分貢獻率與酶解液相比，變化最大。12 h 和24 h 在第1 主成分軸上分布較為靠近，18 h 和24 h 在第二主成分上分布較為集中。12，18 和24 h 的3 組樣品在PCA 圖上較為集中。各組數據區域間沒有重疊，說明不同發酵時間酶解液的風味成分可以通過PCA很好地區分開來[18]。由圖2可以看出，發酵12 h 的發酵脫腥液苦澀味輕，且具有海鮮的香味，與其它4 組相比更受歡迎，因此整體分值較高。綜合電子鼻和感官評價結果，最適脫腥時間為12 h。

圖1 不同發酵時間酶解液的PCA 圖Fig.1 PCA diagram of enzymatic hydrolysate at different fermentation time

圖2 不同發酵時間酶解液的感官評價Fig.2 The sensory evaluation of enzymatic hydrolysate at different fermentation time

2.2 發酵溫度對脫腥苦效果的影響

不同發酵溫度下發酵脫腥液的PCA 和感官評價結果如圖3和圖4。由圖3可知，不同發酵溫度下樣品PC1 的貢獻率達到98.67%，PC2 的貢獻率為0.98%，總貢獻率為99.65%，大于95%，說明所受干擾很小。酶解液和發酵脫腥液相比，PC1 變化很大。而不同發酵溫度的發酵脫腥液PC1 變化不明顯。酶解液與30，40 ℃發酵脫腥液PC2 變化差異不明顯，45 ℃和35 ℃的發酵脫腥液與其它樣品之間風味變化差異明顯。發酵脫腥液的香氣成分與酶解液相比有明顯變化，說明耐鹽酵母發酵可以很明顯的改善酶解液的風味[18]。由圖4可以看出，30 ℃發酵脫腥液有較明顯的苦澀腥味；35 ℃發酵脫腥液苦澀味很淡，但腥味比較明顯；45 ℃發酵脫腥液較30 ℃和35 ℃口感好，但與40 ℃相比，還有苦澀腥味；40 ℃發酵脫腥液效果最佳、分值最高，最受歡迎，因此選擇40 ℃為最適脫腥溫度。

2.3 加鹽量對脫腥苦效果的影響

不同加鹽量發酵脫腥液的PCA 和感官評價結果如圖5和圖6所示。由圖5可知，不同加鹽量樣品PC1 的貢獻率達到86.35%，PC2 的貢獻率為9.94%，總貢獻率為96.29%，大于95%，說明所受干擾很小。PC1 相對穩定，與酶解液相比都有明顯的變化，在加鹽量為10%出現了最大值。PC2 則隨著加鹽量的增加，逐漸下降，呈減少的趨勢。各組數據區域間沒有重疊，說明不同發酵時間的酶解液的風味成分可以通過PCA 很好的區分開來。綜合評定，酶解液和發酵脫腥液比較，前后的風味成分有明顯的變化，說明發酵能改善酶解液的風味[18]。從氣味上來說，每組的發酵味都相對較淡；從滋味上來說，加鹽量為5%的入口很淡，加鹽量為10%和20%的開始嘗不出苦澀腥味，但后續就會有較明顯的苦澀腥味，且20%加鹽量咸味過重，加鹽量為15%時分值最高，最容易被人接受。因此，15%的加鹽量最佳。

圖3 不同發酵溫度酶解液的PCA 圖Fig.3 PCA diagram of enzymatic hydrolysate at different fermentation temperature

圖4 不同發酵溫度對酶解液的感官評價Fig.4 The sensory evaluation of enzymatic hydrolysate at different fermentation temperature

圖5 不同加鹽量酶解液的PCA 圖Fig.5 PCA diagram of enzymatic hydrolysate with different amounts of salt

圖6 不同加鹽量酶解液的感官評價Fig.6 The sensory evaluation of enzymatic hydrolysate with different amounts of salt

2.4 酶解工藝正交試驗結果及條件驗證

2.4.1 酶解工藝參數優化正交試驗結果 發酵工藝參數優化的正交試驗設計及結果見表4。由極差分析可知，經L9（33）正交試驗后，得到最優組合條件為脫腥時間12 h、脫腥溫度35 ℃、加鹽量15%，其順序為C2B1A2。

2.4.2 最優組合條件驗證 稱取一定量的酶解液，按其質量的2%，15%和0.1%添加葡萄糖、鹽和酵母，于35 ℃下恒溫培養12 h 后，制備得到發酵脫腥液，測得發酵脫腥液氨基酸態氮含量為0.2685 g/100 mL，高于正交試驗中的所有組分測得的氨基酸態氮值，說明試驗具有可靠性。

2.5 酶解液電子鼻分析

對鱈魚骨的酶解液和脫腥液電子鼻分析結果如圖7所示。由圖可知，PC1 的貢獻率達到100%，第2 主成分的貢獻率為0%，總貢獻率為99.996%，大于95%，說明所受干擾很小，表明2 個主成分已經基本代表了樣品的主要信息特征。圖中，酶解液與脫腥液PC1 變化穩定，有明顯的上升趨勢，PC2基本沒變化，但其所占面積較廣，呈橢圓形，說明數據信息比較分散，測定存在誤差。其次，脫腥前后樣品的揮發性風味差異明顯，而此差異能在PC1、PC2 構建的平面上充分展示，并且在平面上分布很有規律性，隨著溫度的升高，樣品沿PC1 軸向右分布。各組數據區域間沒有重疊，說明酶解液與脫腥液的風味成分可以通過PCA 很好的區分開來[18]。

表4 正交試驗設計及結果Table 4 Orthogonal array design and results

圖7 脫腥反應前、后酶解液的PCA 圖Fig.7 PCA diagram of the enzymatic hydrolysate before and after deodorization

2.6 酶解液SPME/GC-MS 分析

酶解液和發酵脫腥液的GC-MS 結果見表5。從表可知，酶解液發酵前后揮發性風味成分發生了變化，酶解液中共檢測到9 種香氣活性化合物，其中包括醛類4 種、酮類2 種、醇類1 種、醚類1種、吡嗪類1 種。經過發酵脫腥后，發酵脫腥液香氣活性化合物明顯增多，檢測到18 種香氣活性化合物，其中包括醇類6 種、醛類4 種、吡嗪類3 種、酮類2 種、呋喃類2 種、酚類1 種。

如表5所示，發酵前后醛類物質數量無變化，其中有惡臭的3-甲硫基丙醛變成了癸醛，有苦杏仁味的苯甲醛含量減少，說明在發酵過程中，醛類物質含量的減少可能是因為醛屬于不穩定的中間體化合物，容易在發酵過程中被氧化和還原形成相應的酸或醇[19]。醛類具有較低的閾值，能給予清香、果香和堅果香的芳香特質，是食品中重要的揮發性成分[20]。

醇類通常具有植物香、芳香氣味，是發酵過程中的主要成分。醇類化合物的閾值較高，對整體風味貢獻較小[21]。經發酵后，一是醇類物質種類明顯增多，占總量的77.80%?？赡苁怯芍舅岬拇渭墯溥^氧化物的分解[22]、脂質氧化酶對脂肪酸的作用[23]、脂肪的氧化分解生成或由羰基化合物還原生成醇[24]，脫氫酶也可以將由脂肪酸和氨基酸生成的醛還原成相應的醇[25]。其次，醇類物質可能來源于酵母發酵過程中有氧呼吸和無氧呼吸時產生。

表5 酶解液GC-MS 測定結果Table 5 The results of GC-MS determination of enzymatic hydrolysate

酮類另一種重要的呈味物質對溶液風味變化也起著重要作用。如表所示酮類物質種類無變化，但含量減少，適量的酮類貢獻甜的花香和果香風味，而過量的酮類則會產生不良氣味。酮類主要是脂肪酸的自動氧化或由Strecker 反應產生的氨基酸降解形成的[21]。另外，呋喃作為肉制品中的重要雜環，也可能影響魚骨酶解液的香氣。

2.7 發酵脫腥液氨基酸分析

最優組發酵脫腥液氨基酸組成及主要呈味特性[26-27]見表6，測得氨基酸總量為6 177.28 mg/100 g。由表6可知，谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸這3 種氨基酸的含量明顯高于其它氨基酸，而甘氨酸、賴氨酸等必需氨基酸的含量也較高，酪氨酸含量最低，它們分別占總量的14.23%，11.06%，9.19%，8.26%，7.81%，2.20%。發酵液呈鮮、甜氨基酸占總量的58.2%，產品鮮味突出，可能是酶解液中的小分子多肽起了主要鮮味作用或產生的醇厚感肽對鮮味起了增強作用，同時說明耐鹽酵母發酵對改善脫腥液風味有著較大的作用。

3 結論

通過正交試驗確定了鱈魚骨酶解液脫腥苦的最佳工藝：發酵溫度35 ℃、發酵時間12 h、加鹽量15%。電子鼻的PCA 圖說明發酵前后風味物質有很明顯的變化，可以很好地區分發酵前后的酶解液風味。通過SPME/GC-MS 對脫腥反應前后香氣化合物成分進行分析，發現通過脫腥反應可以明顯增加酶解液的風味成分，尤其是香氣活性化合物明顯增多，揮發性風味物質主要為醛類、酮類、酚類、醇類、呋喃等化合物。氨基酸的測定結果表明：谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸這3 種氨基酸的含量明顯高于其它氨基酸，而它們分別代表鮮味和甜味，充分說明發酵對酶解液脫腥苦起著重要的作用。本研究建立了酶解液脫腥苦工藝，為其深加工及高值化利用提供一定的理論依據和技術支持。

表6 氨基酸成分含量表Table 6 Amino acid content