單菌與混合菌固態生物轉化大黃素的比較研究＊

蘭 慧，陽 敬＊＊，李姝梅，趙榮華

（1. 紅河衛生職業學院藥學院 蒙自 661199；2. 云南中醫藥大學中藥學院 昆明 650500）

大黃素（Emodin）是一種重要的天然藥物成分，化學名為1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌（1,3,8-trihydroxy-6-methylanthra quinone）屬蒽醌類成分[1]，大黃素又稱朱砂蓮甲素[2]，主要來源于蓼科的大黃、何首烏、虎杖以及豆科的決明等植物中，是大黃、何首烏藥材的質量控制成分。大黃素在多種植物中含量高，提取精制容易，具有抗菌、抑制免疫、解痙、止咳和抗癌等藥理作用[2]。為了進一步提高大黃素生物活性，發現新用途，近年來，國內外以大黃素作為前體藥進行化學結構修飾，設計合成了許多活性較好的大黃素衍生物。

近年來，生物轉化方法具有選擇性強、副產物少，反應條件溫和，污染環境小等特點，已成為結構修飾的重要手段。微生物轉化技術與化學轉化相比，無論在轉化速度還是轉化質量等方面均表現出了顯著優勢，被廣泛應用于天然藥物成分的合成轉化和代謝機理研究[3]，生物轉化也稱發酵。目前，中藥成分的微生物發酵轉化技術是人類獲得結構新穎、獨特、低成本、低毒性和高活性藥物的重要途徑之一[4]。發酵應用于中藥，能利用微生物分解轉化能力，改變中藥原有性能，增強或產生新的功效，擴大用藥品種，使得中藥更適應于臨床用藥的需要[5]。

中藥微生物發酵主要有2 種方式：固體發酵和深層發酵（液體發酵）。固體發酵是指利用微生物在潮濕的沒有自由流動水的固體基質上生長代謝的技術[6-7]。固體發酵歷史悠久，是一種比較成熟的發酵方式，操作和所需設備簡單[8]。如以玉米為底物，采用Shiraia sp.SUPER-H168進行固體發酵，能夠大量產生竹紅菌素A[9]。秦俊哲等[10]用中藥渣代替傳統原料進行靈芝固體發酵，發現其固體菌絲中多糖含量和氨基酸含量都大大提高，不僅提高了藥效，而且節約了藥用資源。國外固態發酵在酶的生產[11-13]等方面己顯示了良好的應用前景。近年來，對固態發酵原理和應用的研究使得清潔、節能的固態發酵已然成為發酵工業的關注熱點[14]。固態發酵已引起很大的重視，因為這種生物過程可有效地轉換廉價的農工業廢渣、植物和各種各樣有價值的化合物[15]。由于藥物具有不同的特性，因此，研究人員能夠根據藥物之間的差異性進行有目的的組合，采用單一或混合菌種來進行微生物的定向發酵，或定向改變藥物的性能[16]。

我國早在4000 多年前就開始將真菌轉化食品和中藥炮制等。中國傳統的中藥，如六神曲、淡豆豉、半夏曲、紅曲、豆黃等，均是通過利用自然界的微生物（如霉菌、酵母等）固態轉化后而形成的藥物。我國是世界上最早直接利用真菌防病治病的國家，早在東漢年間的《神農本草經》中就有靈芝、茯苓、豬苓、雷丸等藥用真菌分別列項論述，至今沿用不衰。真菌具有分解纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等營養物質的強大酶類，對天然培養基有較強的分解利用能力[17]。目前，單株菌應用于中藥比較多見，如游松等[18]采用多個菌株對白藜蘆醇苷進行發酵轉化研究，篩選后獲得一株絲狀真菌Syncephalastrum racemosum3.264，該菌能將白藜蘆醇苷高效轉化為白藜蘆醇，純化后白藜蘆醇純度高達98%。董悅生等[19]利用哈茨木霉CGMCC 2979直接轉化藥材，將梔子中的京尼平苷轉化為京尼平，48 h京尼平苷的轉化率為97.8%。馬超等[20]用酵母轉化大黃結合型蒽醌得到游離型蒽醌，從而減輕大黃的峻烈瀉下作用。杜晨暉等[21]用米根霉生物轉化何首烏及大黃素得到化合物大黃素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，并發現后者抑菌效果比前者好。朱培芳等[22]運用從生長何首烏的土壤中分離的一株鐮孢霉屬（Fusarium）菌株轉化何首烏及大黃素得到化合物ω-羥基大黃素。

混合菌廣泛存在于大自然中，是一類重要的微生物，對藥物的生物轉化作用強大，且生物轉化作用機理比單株菌復雜，是多環節對多成分的作用，越來越受到人們的關注。目前，單株菌應用于中藥及化學成分比較多見，而混合菌應用于中藥及化學成分的研究相對較少。許多化學過程通過單酶（細胞）一步生物催化反應往往無法實現，因而目前生物催化已從先前單酶（細胞）催化體系向著多酶（細胞）耦合催化體系的方向發展，構建和利用這種體系，在同一反應器中自由組合不同的生物反應過程將是下一代工業生物催化技術發展所面臨的挑戰之一。

混合菌用于纖維素發酵已取得一定的研究成果。謝瓊霞等[23]利用多種分解纖維素的菌種進行混合發酵甜高粱秸稈可使其降解率最高，糖化率達到3.19 mg·mL-1。張建強等[24]用混合菌發酵可提高纖維素的降解能力，從土壤樣品中分離、篩選出一組對纖維素具有高效降解作用的混合菌，初步鑒定為毛霉菌（Mucor sp.）和曲霉菌（Aspergillus sp.）。魏培蓮[25]運用土曲霉和紅曲霉混合固態發酵，提高固態基質中的生物量和洛伐他汀的產量?；旌暇糜谥兴幇l酵已有相關報道，石鴻輝等[7]以黑曲霉、產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌為發酵菌種進行固態好氧發酵，在相同條件下比較單一菌種或混菌組合對辣木莖葉粉的營養成分、抗營養成分及抗氧化活性的影響。結果表明，混菌發酵的效果優于單一菌種。此外，還有一些專利如中藥多菌種混合發酵口服液的配制及其生產工藝，中藥多菌種混合固態發酵技術及其應用。

目前，對單菌與混合菌生物轉化大黃素的比較研究鮮有報道，本研究將單菌與混合菌固態生物轉化大黃素進行比較研究，為提高中藥材中大黃素微生物轉化產率提供一種選擇，為大黃素單菌與混合菌轉化奠定一定的數據支持與理論基礎，為大黃素及中藥材中大黃素微生物轉化提供一種新的思路。

1 實驗材料和方法

1.1 菌種

菌種58 株，26 組混合菌（由云南大學微生物研究所提供44 株，由成都微生物研究所提供1 株，由本實驗室提供8 株，由自行分離提供5 株，本實驗室保存的菌株）?；罨蠼臃N到PDA 斜面培養基，0℃-4℃保存。

1.2 試劑與儀器

大黃素標準品（批號0756-200110，中國藥品生物制品檢定所）；大黃素（批號為060803，純度為98.07%，西安中鑫生物技術有限公司）；ω-羥基大黃素（實驗室分離，純度達到95%）；麩皮（市售）。高效液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000 系列，USA）：Dionex P680 四元梯度泵、Dionex ASI-100 自動進樣系統、Dionex PDA-100 二極管陣列檢測器、Dionex LPG-3400 真空在線脫氣機、Dionex TCC-100 柱溫箱、Chromeleon 6.8色譜工作站；島津十萬分之一電子天平（Auw220D，島津國際貿易（上海）有限公司）；SK7210HP 超聲振蕩器（上?？茖С晝x器有限公司）；Agilent TC-C18（4.6 × 250 mm，5 μm，USA）。

1.3 培養基

1.3.1 斜面培養基

斜面培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2.0%，瓊脂1.5%，pH自然。

1.3.2 發酵種子培養基

發酵種子培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2.0%，pH自然。

1.3.3 發酵培養基

發酵培養基：大黃素0.25%，麩皮99.75%，pH自然。

1.4 大黃素和大黃素發酵物中大黃素、ω-羥基大黃素含量測定[22]

1.4.1 大黃素對照品及ω-羥基大黃素對照品標準曲線的制作

分別精密稱取大黃素對照品，ω-羥基大黃素對照品，加適量甲醇溶解，定容后作為對照品溶液。大黃素、ω-羥基大黃素對照品溶液的濃度分別為0.28 mg·mL-1、0.342 mg·mL-1。根據 2015 年版《中華人民共和國藥典》HPLC 測定大黃素的方法，并建立HPLC 測定大黃素及ω-羥基大黃素的方法學考察，大黃素對照品的標準曲線為Y = 57670X-2.6751，相關系數為0.9999，線性范圍（mg）為2.8 × 10-3-8.4 × 10-3；ω-羥基大黃素對照品的標準曲線為Y = 61316X + 1.0387，相關系數為0.9999，線性范圍（mg）為1.71×10-5-3.42×10-3。

1.4.2 大黃素和大黃素發酵物中大黃素、ω-羥基大黃素含量測定方法

樣品處理：稱取上述大黃素轉化產物1.0 g 加入10 mL 甲醇，稱重，超聲振蕩30 min，甲醇補足重量，搖勻，濾紙過濾，棄去初濾液，取續濾液，以0.45 μm 濾膜濾過，取過濾液作為測定大黃素固態轉化樣品的供試品溶液。按上述方法，同時制備不加入大黃素的陰性空白對照品溶液。

大黃素、ω-羥基大黃素含量測定：利用Dionex Ultimate 3000自動進樣器的自動吸液-混合-進樣功能（Draw-Mix-Inject），吸取樣品液，然后吸取純甲醇液適量，按色譜條件流動相：A：甲醇，B：0.1%磷酸溶液，流速：1 mL·min-1，柱溫：30℃，檢測波長：254 nm，記錄時間：25 min 測定，使進樣量保持在20 μL，各個成分制備6 個濃度點（n=6），每個濃度進樣兩次。以峰面積（Area）為縱坐標，進樣量（mg）為橫坐標，回歸計算各個標準品的標準方程及其相關系數，計算大黃素、ω-羥基大黃素含量。

1.5 發酵培養方法

挑取一環新鮮斜面菌種，接種于已經高壓滅菌的裝有100 mL 種子培養基的250 mL 三角瓶中，其中28℃，110 rpm 搖床培養96 h 作為種子；按10%的種子液（單菌加入10%的種子液，混合菌中兩株菌各加入5%），接種量將種子培養液接入裝有已經高壓滅菌的大黃素25 mg、麩皮10 g，的500 mL 三角瓶中，于無菌操作條件下加入8 mL 水，用無菌鋼鏟充分攪拌均勻。同時，按上述方法制備不接菌的大黃素培養基作為空白對照，按上述方法制備接菌不加大黃素培養基作為菌株陰性空白對照，將待轉化樣品、空白對照品及菌株陰性空白對照放入生化培養箱或恒溫培養箱中，在28℃條件下培養至轉化物由棕黃色變棕紅色，菌絲布滿整個轉化物表面及瓶底時，將三角燒瓶從恒溫培養箱中取出，培養時間為120 h。

1.6 薄層層析

將大黃素發酵提取物、標準品大黃素、ω-羥基大黃素點樣于硅膠板上，分別以大黃素轉化產物展開劑乙酸乙酯：甲醇：甲酸（15∶1∶0.5），氯仿：甲醇：甲酸（9∶1∶0.5），環己烷：甲醇：甲酸（1∶1∶0.5）為展開劑展開，在365 nm紫外燈下檢視[26]。

2 結果與分析

2.1 大黃素轉化產物中大黃素、ω-羥基大黃素的含量測定。

按上述色譜條件進樣，測得不同固態轉化的各樣品ω-羥基大黃素、大黃素的含量。計算公式[27]為大黃素投料量的折算值=大黃素投料量×（空白不加菌對照品的測得量/空白不加菌對照品的投料量）；ω-羥基大黃素的生成率=ω-羥基大黃素的量/大黃素投料量的折算值× 100%；大黃素的轉化率=（總大黃素量-剩余大黃素量）/大黃素投料量的折算值×100%。

用58 株菌對大黃素進行固態轉化，有57 株已轉化大黃素，39 株能轉化生成ω-羥基大黃素，所以只對已轉化的產物進行分析。34 株轉化產物ω-羥基大黃素生成率越大，大黃素轉化率也越大，5 株菌YIM39335、YIM3088、YIM3210、YIM3015 和 YZ3.62例外。

2.2 大黃素轉化率最高的7組混合菌與組成這7組混合菌的單菌比較

本實驗是為了尋找大黃素轉化率高的菌株組合，并考察組合混合菌的各單菌之間是否存在協同作用，所以只對轉化率高的混合菌與組合混合菌的各單菌比較（表1、圖1）。

在29組混合菌固態轉化產物中，轉化產物的大黃素轉化率最高的7 組混合菌分別為YIM321801:YIM3088、YIM321801:YIM3058、YZ3.41:YIM321812、YIM3234: YZ3.9015、YZ3.41: YZ3.72、8-66: YZ3.42、YIM3234: 8-66，其 轉 化 率 依 次 為 60.1%、34.7%、26.6%、22.7%、21.5%、20.3%、20.2%（表1）。

可以看出，菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用 ，菌株 YIM321801 與菌 株YIM3058 合用，菌株YZ3.41 與菌株 YIM321812 合用，菌株 YIM3234 與菌株YZ3.9015 合用，菌株 YZ3.41 與菌株 YZ3.72 合用，菌株YIM3234 與菌株8-66 合用，均能使大黃素轉化率增高，其中菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用效果最為顯著，大黃素轉化率達到60.1%，而單菌YIM321801大黃素轉化率僅為30.7%，單菌YIM3088 大黃素轉化率僅為21.1%。菌株YZ3.41 與菌株YZ3.72 合用效果較為顯著，大黃素轉化率達到21.5%，而單菌YZ3.41大黃素轉化率僅為9.1%，單菌YZ3.72 大黃素轉化率僅為8.2%。菌株YZ3.41 與菌株YIM321812 合用效果也較為顯著，大黃素轉化率達到26.6%，而單菌YZ3.41大黃素轉化率僅為9.1%，單菌YIM321812大黃素轉化率僅為19.1%。

2.3 ω-羥基大黃素生成率最高的8 組混合菌與組成這8組混合菌的單菌比較

為了尋找ω-羥基大黃素生成率高的菌株組合，并考察組合混合菌的各單菌之間是否存在協同作用，所以只對高ω-羥基大黃素生成率的混合菌與組合混合菌的各單菌比較，8 組混合菌與單菌固態轉化產物的ω-羥基大黃素生成率（表2、圖2）。

在29 組混合菌固態轉化產物中，轉化產物的ω-羥基大黃素生成率最高的8 組混合菌分別為YIM321801:YIM3088、YIM321801:YIM3058、YZ3.41:YIM321812、YIM3234: YZ3.9015、YZ3.42: YZ3.9015、YIM3001:YIM39321、米根霉:YZ3.72、YZ3.41:YIM39321，其ω-羥基大黃素生成率依次為32.9%、22.4%、13.7%、12%、9.6%、9.2%、8.9%、8.5%（表2）。

可以看出，菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用 ，菌 株 YZ3.41 與 菌 株YIM321812 合 用 ，菌 株YIM3234 與菌株 YZ3.9015 合用，菌株 YIM3001 與菌株YIM39321 合用，菌株 YZ3.41 與菌株 YIM39321 合用，均能使ω-羥基大黃素生成率增高，其中菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用效果最為顯著，ω-羥基大黃素生成率達到32.9%。而單菌YIM321801ω-羥基大黃素生成率僅為22.8%，單菌YIM3088 大黃素轉化率僅為0.8%。菌株YIM3001與菌株YIM39321合用效果較為顯著，ω-羥基大黃素生成率達到9.2%，而單菌YIM3001ω-羥基大黃素生成率僅為1.1%，單菌YIM39321ω-羥基大黃素生成率僅為3.0%。菌株YZ3.41與菌株YIM321812合用效果較為顯著，ω-羥基大黃素生成率達到13.7%，而單菌YZ3.41ω-羥基大黃素生成率僅為7.1%，單菌YIM321812ω-羥基大黃素生成率僅為10.7%。

表1 7組混合菌與單菌固態轉化產物的大黃素轉化率

圖1 （Ⅰ、Ⅱ）混合菌與單菌固態轉化產物的大黃素轉化率比較

表2 8組混合菌與單菌固態轉化產物的ω-羥基大黃素生成率

圖2 （Ⅰ、Ⅱ）混合菌與單菌固態轉化產物的ω-羥基大黃素生成率比較

2.4 混合菌轉化產物中ω-羥基大黃素生成率及大黃素轉化率最高的HPLC圖譜

2.5 菌株固態轉化產物的其他情況

產生成分種類最多的菌株分別是8-66，共有8 種未知成分（除ω-羥基大黃素外）。58 株菌中具有轉化能力的菌株有57 株，能轉化成ω-羥基大黃素的有39株。其中專一性較強（只產生1 種成分）的有YZ3.9022、YZ3.9024、YZ3.9021、YZ3.9023、YIM39439、YZ3.9032、YZ3.9034、YIM39409 共 8 株菌，其中菌株YIM39439 轉化產物產生ω-羥基大黃素，生成率為0.4%，其余7 株轉化產物均沒有產生ω-羥基大黃素，其大黃素轉化率依次為5.5%、0.6%、2.5%、0.4%、0.6%、2.3%、1.0%、1.2%。

3 結論

本研究分別用單菌與混合菌固態轉化大黃素，并對大黃素的轉化率和ω-羥基大黃素的生成率進行比較研究，實驗結果表明，一些混合菌能提高ω-羥基大黃素生成率和大黃素轉化率。即組成混合菌的兩單菌間存在協同作用。研究發現3組協同作用非常顯著的混合菌YIM321801（青霉屬Penicillium）:YIM3088（臺灣根霉Rhizopus formosensis）、YIM321801（青霉屬Penicillium）:YIM3058（土 曲 霉 Aspergillus terreus）、YZ3.41（茄腐皮鐮刀 Fusarium solani）:YIM321812（毛霉屬Mucor），轉化率依次為60.1%、34.7%、26.6%。其中最顯著的是YIM321801（青霉屬 Penicillium）:YIM3088（臺灣根霉Rhizopus formosensis），大黃素轉化率達到60.1%。轉化產物的ω-羥基大黃素的生成率最高的3 組混合菌分別為YIM321801:YIM3088，YIM321801:YIM3058 及 YZ3.41:YIM321812，其生成率依次為32.9%、22.4%、13.7%。

圖3 混合菌轉化產物中ω-羥基大黃素生成率及大黃素轉化率最高的HPLC圖譜

生物轉化過程十分復雜，受多種因素的影響，實驗中絕大多數混合菌比單菌大黃素轉化率和ω-羥基大黃素生成率高，即混合菌比單菌生物轉化大黃素強，各種菌株組合成的混合菌起到了協同作用。特別是功能弱的菌株組合后功能增強，起到協同作用。這可能是因為單菌發酵時微生物的代謝產物大量積累阻礙相關酶類的合成，而混合菌發酵中各菌株大多可以起到生長代謝協調作用，某些微生物如真菌能夠利用這些代謝產物，從而解除這種阻礙作用，促進相關酶類的合成，使得實驗中混合菌比單菌生物轉化大黃素具有明顯的優勢。

新型的固態發酵方式有利于條件的控制及擴大規模生物轉化，轉化條件簡單，為以后的生產及生物轉化提供了可行性。一些混合菌生物轉化大黃素作用顯著，即組成的這些混合菌的單菌之間存在一定的協同作用，混合菌轉化大黃素使得大黃素得到了進一步開發利用，為提高中藥材中大黃素微生物轉化產率提供一種選擇，為大黃素單菌與混合菌轉化奠定一定的數據支持與理論基礎，為大黃素及中藥材如大黃、何首烏、虎杖的炮制、生物代謝等微生物轉化提供了一種新的思路。