殼聚糖-咖啡酸衍生物涂膜對多寶魚保鮮效果的研究

唐森，何劍，張義浩，張鵬，吳國勇，*

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西來賓546119；2.廣西科技師范學院功能性食品配料工程技術研究中心，廣西來賓546119）

多寶魚原生長地為歐洲的大西洋區域，通常被稱 作“歐洲比目魚”，多寶魚味道香鮮甜美、口感軟嫩爽滑、富含膠質蛋白還可以助陽提神、補腎健腦；經常食用不僅可以滋補身體，還可以提高人體的抗病毒能力[1]。但由于其生長環境的不同以及微生物的影響，其在運輸以及加工的過程中易發生變質和腐敗[2]。因此需要尋求一種無污染、高安全、高效的保鮮手段，來抑制多寶魚在運輸加工過程中的腐敗變質，維持其新鮮程度以及風味，使多寶魚的貨架期得到更好的延長，提高其經濟價值。

殼聚糖（chitosan）是自然界中廣泛存在的一種大分子物質。由于其具有良好的成膜性和廣譜抑菌性且天然無毒易降解、可再生等特點被廣泛應用于食品保鮮工程、制藥、紡織、農業、污水處理和化妝品等眾領域[3-9]。但由于殼聚糖分子間存在著強氫鍵，不易溶于水，因此，對殼聚糖進行改性，增加其抗氧化能力及其抗菌能力并賦予殼聚糖新的特性是殼聚糖研究領域的一大熱點。

咖啡酸（caffeic acid）是自然界中一種天然存在的酚酸，其固體使一種黃色的晶狀物，其具有抗氧化、調節免疫和抗氧化等多種生物活性[10-14]，在過去的研究中，已有部分研究人員通過接枝反應構建以咖啡酸等酚酸與殼聚糖反應生成復合材料，期望提高殼聚糖的溶解性能以及抗菌性能[15-16]。

本文通過接枝反應在殼聚糖中引入咖啡酸，形成具有殺菌抑菌活性的殼聚糖-咖啡酸衍生物，并研究衍生物對多寶魚冷藏保鮮期間（4℃）揮發性鹽基氮、菌落總數、pH值、持水力以及感官評價變化，探索其延長魚肉貨架期的保鮮機理，為制備以生物大分子為基質的涂膜材料提供一定的理論依據，為多寶魚等水產品的冷藏保鮮提供一種新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多寶魚：來賓市興賓區大洋百貨商場，約500 g一尾；殼聚糖：山東西亞化學股份有限公司；咖啡酸：武漢長成化成科技發展有限公司；平板計數瓊脂：上海博微生物科技有限公司；抗壞血酸、30%過氧化氫（H2O2）、冰乙酸、氯化鈉、氧化鎂、硼酸、95%乙醇、甲基紅、溴甲酚綠、甲基橙：國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TYAIB 024/10立式壓力滅菌鍋：寧波久興醫療器械有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：上海博迅實業有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱：廣州深華生物技術有限公司；PHS-3E數字式pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；ZNBC-CL電熱套：鞏義市科瑞儀器有限公司；FA2004B電子天平：上海精科儀器有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌加熱器：金壇市醫療儀器廠；DW-HL218型超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司：FD5-3冷凍干燥機：廣西東盟國際集團有限公司；KDN-08B型半自動凱氏定氮儀：上海新嘉電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 殼聚糖-咖啡酸衍生物的制備

在裝有1%冰醋酸的去離子水（1 000 mL）大燒杯中加入10.00 g的殼聚糖，并在500 r/min的磁力攪拌器下不停歇攪拌8 h使殼聚糖溶解，溶解結束后裝入試劑瓶靜置備用。在250mL的三頸燒瓶中加入100mL制備好的殼聚糖溶液，再加入過氧化氫和抗壞血酸，不斷攪拌30 min，后加入0.2 g的咖啡酸反應12 h，整個反應使用惰性氣體氮氣進行保護，以免除空氣的影響。結束反應后用8 kDa～14 kDa透析袋透析反應溶液，以除去反應液中多余未反應的咖啡酸、VC等小分子化合物。透析池中蒸餾水每12 h更換一次，共透析72 h。透析結束后對透析液冷凍干燥，即得到殼聚糖-咖啡酸衍生物[17]。

1.3.2 涂膜溶液的配制

空白組：用去離子水清洗多寶魚后，不做其它處理。

咖啡酸組：用去離子水配制質量分數為0.20%的咖啡酸溶液（含1%的冰醋酸）。

殼聚糖組：用去離子水配制成質量分數為2%的殼聚糖溶液（含1%的冰醋酸）。

殼聚糖咖啡酸混合物組：用去離子水配置含質量分數為0.20%的咖啡酸以及質量分數為1.8%的殼聚糖水溶液，制成混合涂膜液（含1%的冰醋酸）。

殼聚糖咖啡酸接枝物組：用去離子水配置質量分數為2%殼聚糖-咖啡酸衍生物的生物涂膜液。

1.3.3 涂膜保鮮設計

參照SC/T 3016-2004《水產品抽樣方法》方法取樣，除去魚鱗、魚皮等部分，取其腹部及背部肌肉，再將其肌肉攪碎，稱取適量的樣品放置于燒杯中，并分別加入5種涂膜處理溶液，浸泡0.5 h，瀝干水分，晾干后用殺菌后的自封袋分裝，分別貼好標簽，全部放置于冰箱中冷藏（4℃）。之后每24 h取處理后的5組樣品測其揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）含量、菌落總數、pH值、持水力等理化指標，并進行感官評價。

1.4 理化指標的測定

1.4.1 感官評價

由7名感官評定人員進行感官評價試驗，冷藏和常溫條件下的感官評定方法參照胡金鑫[18]的感官評定標準并稍作修改。

1.4.2 TVB-N含量的測定

按GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》半微量定氮法測定保鮮期間多寶魚的揮發性鹽基氮，測定3次取其平均值。

1.4.3 菌落總數

按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》要求操作測定多寶魚冷藏保鮮期間的菌落總數，測定3次取其平均值。

1.4.4 pH測定

待測樣品10 g放入帶有瓶塞的錐形瓶中，并加入100.0 mL去離子水，不停的搖晃，使樣品在試液分布均勻，浸泡0.5 h后，用校正后的pH計測定其pH值，測定3次取其平均值。

1.4.5 持水力

取待測的多寶魚樣品，放置于雙層濾紙之間，向其施加5 kg重的砝碼，并保持2 min，其持水性以壓出水分來表示。持水性按下式計算：

式中：w1為魚肉質量，g；w2為除水后的質量，g；w為樣品水分含量，%。

每組參數重復測量3次，按公式計算后取均值，作為持水性指標。

2 結果與分析

2.1 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間感官評分變化

不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間感官評分變化見圖1。

圖1 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間感官評分變化Fig.1 Sensory score changes of turbot after different coating treatments

由圖1可以看出，感官評分下降最快的是未做涂膜處理的空白對照組，而下降最慢的是殼聚糖咖啡酸衍生物組，咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組的評分差距較小?？瞻捉M從第2天開始，感官評分與其他處理組相比已經有了一定差距。到第3天的時候，空白組的評分已經在輕微腐敗的評分范圍以內。在第3天前，殼聚糖咖啡酸衍生物組與咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組感官評分并沒有特別明顯的差異，但在第3天之后，用殼聚糖咖啡酸衍生物涂膜處理的多寶魚感官評分明顯比其他的組要高，且在試驗末期殼聚糖咖啡酸衍生物涂膜處理的試驗組評分仍在處于很高的水平內，其原因可能是與咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合物相比殼聚糖咖啡酸衍生物更加具有抗菌、抗氧化的能力。由此可反映出殼聚糖咖啡酸衍生物可以更好的抑制微生物繁殖，使魚肉腐敗減慢，使魚的品質得到更好的保留，延長其貨架期。

2.2 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間TVB-N變化

不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間TVB-N變化見圖2。

圖2 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間TVB-N變化Fig.2 TVB-N changes of turbot after different coating treatments

如圖2所示。本次試驗中TVB-N的初始值為7.8 mg/100 g。隨著冷藏保鮮時間的增加，所有試驗組的TVB-N的值均不斷升高，且空白組的TVB-N值在第3天之后要明顯要高于其他的涂膜組。殼聚糖咖啡酸衍生物組在整個冷藏保鮮期間的TVB-N值都明顯低于空白、咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合試驗對照組。冷藏保鮮的第3天咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合試驗對照組TVB-N值均不在一級鮮肉標準（15 mg/100 g）范圍以內，不屬于一級鮮肉，而空白對照組在第2天的時候就已經超出一級標準范圍，并且試驗末期（第5天）空白對照組已經超出了二級鮮肉標準（30 mg/100 g）范圍，在整個試驗過程中殼聚糖咖啡酸衍生物組的TVB-N值均在一級鮮肉標準范圍內。TVB-N主要是由于魚肉中存在的細菌腐敗分解產生，殼聚糖咖啡酸衍生物組TVB-N的值較低的原因是因為與咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合試驗對照組相比，殼聚糖咖啡酸衍生物涂膜處理能夠使微生物的生長繁殖受到阻礙，使魚肉中蛋白質等營養物質的分解得到抑制，使得保鮮效果更加的明顯。

2.3 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間菌落總數變化

不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間菌落總數變化見圖3。

圖3 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間菌落總數變化Fig.3 Total number of colonies changes of turbot after different coating treatments

菌落總數的測定是衡量多寶魚等肉類產品腐敗程度的一個重要指標，魚肉內的微生物會分解魚肉蛋白、氨基酸等營養物質，并且還會生成既有腐敗性征味道的生氨、胺類（腐胺、尸胺、組胺）等物質，因而檢測于體內的菌落總數可以反映出魚肉的腐敗情況。

從圖3可以看出隨著冷藏保鮮天數的增加，不同處理組的菌落總數也在不斷地升高。在第3天之后空白、咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組的菌落數值明顯高于殼聚糖咖啡酸衍生物組?？瞻?、咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組在第3天的時候菌落總數便超過了國家鮮肉標準（lg CFU/g-1=6.0）。同時在試驗末期殼聚糖咖啡酸衍生物組對微生物的抑制作用仍大于咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組并尚在國家鮮肉標準的范圍內。由此可反映出相較于其他處理組，殼聚糖咖啡酸衍生物能夠更好的抑制微生物的生長和增值，起到良好的保鮮作用。

2.4 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間pH值變化

不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間pH值變化見圖4。

多寶魚等水產品在其保鮮儲藏過程中，魚肉的蛋白質等營養物質在微生物和其生理條件的作用下，被分解為一些小分子的堿性物質，因此魚肉的pH值會產生一定的變化。pH值的變化反映了魚體本身的一個酸堿度，一定程度上反映出了多寶魚死后的新鮮程度[19]。

從圖4可看出，本次試驗的樣品pH值都基本是先下降而后再不斷上升。原因是在魚肉冷藏保鮮的初期，魚肉內的發生糖酵解反應，從而生成乳酸、腺苷三磷酸、磷酸肌酸等酸性物質，從而導致了pH值的值下降。試驗的起始pH值較低，可能與涂膜液本身的pH值較低有關[17]。而隨著冷藏保鮮時間的增加，微生物的繁殖變快，會使蛋白質快速分解，并產生氨類等堿性物質，從而使得pH值升高。本試驗的初始pH值為6.65，冷藏期間（第2天之后）空白組的pH值明顯高于其他有涂膜處理的試驗組，且在整個冷藏期間空白組、咖啡酸組、殼聚糖組、殼聚糖+咖啡酸混合組的pH值都比的殼聚糖咖啡酸衍生物組的pH值要高，殼聚糖咖啡酸衍生物pH值最低。說明在冷藏期間殼聚糖咖啡酸衍生物涂膜處理的多寶魚肉腐敗相對于其他的組較為緩慢。由此可知殼聚糖咖啡酸衍生物涂膜液的保鮮效果最佳。

圖4 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間pH值變化Fig.4 pH value changes of turbot after different coating treatments

2.5 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間持水力變化

不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間持水力變化見圖5。

圖5 不同涂膜處理后多寶魚保鮮期間持水力變化Fig.5 Water holding capacity changes of turbot after different coating treatments

魚肉的持水性用持水力作為考察指標，其表示的是當魚肉受到外力作用時保持水分的一種能力，在魚肉蛋白中，蛋白質存在著一種三維的網狀結構，水分子就鑲嵌在其中，當這種三維網狀結構被毀壞時，水分子就被釋放出來，從而導致了持水力的降低[20]。冷藏保鮮過程中持水力的數值越高，說明保水的性能越好，保鮮起到的效果就越好。

如圖5所示，在整個冷藏保鮮期間，所有的多寶魚樣品的持水力均呈下降的趨勢。在第2天之后咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組與殼聚糖咖啡酸衍生物組的持水力對比更加的明顯，在第3天之后空白組對比其他的涂膜保鮮組持水力也有了比較明顯的區別。在整個試驗過程中咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合組的持水力差別不大（差值＜1）。多寶魚的持水力與其肌球蛋白變性有關，咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合、殼聚糖咖啡酸衍生物的涂膜液能夠對多寶魚肉形成一個保護的薄膜，從而抑制了其肌球蛋白變性。而肌球蛋白變性與其水化能力有著一定的聯系。而殼聚糖涂膜材料又減慢了微生物的繁殖，使蛋白質變性減緩，也使得與空白組相比涂膜組的持水力相對較高。從圖中可以看出咖啡酸衍生物組的持水力變化最為平緩，持水力液相對較高，說明殼聚糖咖啡酸衍生物與其它的試驗組對比有著更好的保持魚肉內游離水分的能力。

3 結論

本文以殼聚糖為主體，利用殼聚糖上氨基和羥基作為接枝點，通過接聚共聚反應引入咖啡酸，形成新的殼聚糖咖啡酸衍生物。并以揮發性鹽基氮、菌落總數、pH值、持水力以及感官評價作為評價指標，分析了0.20%的咖啡酸，2%的殼聚糖，0.20%的咖啡酸以及1.8%的殼聚糖，2%殼聚糖-咖啡酸衍生物，無菌水對多寶魚的保鮮效果。結果表明經殼聚糖咖啡酸衍生物處理后的多寶魚，在冷藏保鮮過程中的pH值、菌落總數和揮發性鹽基氮均比咖啡酸、殼聚糖、殼聚糖+咖啡酸混合涂膜處理的試驗組要低，而感官評分則高于對比涂膜處理組。本次試驗中采用殼聚糖咖啡酸衍生物的多寶魚在整個保鮮過程中各項指標均保持在安全可食用范圍內，而其他試驗組在第3天之后各項數據均以超出安全可食用范圍。說明殼聚糖咖啡酸衍生物可以起到更加穩定的抗氧化和抑制微生物的生長作用，使多寶魚的腐敗變質得到減慢，起到了更加良好的保鮮效果。