三七根際土壤中皂苷類自毒物質降解拮抗細菌的分離篩選

王羅濤 楊冬英 鄧琳梅 李怡文 馬云云 韓光煜 黃惠川 朱書生 楊敏

摘要：【目的】篩選出既可降解三七皂苷類自毒物質又能拮抗三七銹腐病菌的細菌菌株，為防治三七病害及克服連作障礙提供生防資源?！痉椒ā坷眠B續稀釋法從健康三七根際土壤中分離可培養細菌，測定細菌菌株在以粗皂苷為唯一碳源培養基上的生長情況，以對峙培養法測定細菌菌株對三七銹腐病菌毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006的拮抗活性;結合16S rDNA測序和形態學特征對活性菌株進行分類鑒定，并通過HPLC測定活性菌株在不同時間內對主要皂苷類自毒物質（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的降解能力?！窘Y果】從三七根際土壤中分離獲得91株細菌分離物，其中17株分離物能在以粗皂苷為唯一碳源的培養基上生長、14株分離物對菌株RS006具有拮抗活性;菌株41既能以三七粗皂為唯一碳源生長，又對菌株RS006具有較強抑制活性。綜合菌株41的形態特征和16S rDNA分子鑒定結果，將菌株41鑒定為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii），編號為PM-41。菌株PM-41對三七主要皂苷類自毒物質R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均存在較明顯的降解效果?！窘Y論】蒙氏假單胞菌PM-41既能拮抗毀滅柱孢菌又能有效降解三七皂苷類自毒物質，具有防治三七銹腐病和緩解三七連作障礙的生防潛力。

關鍵詞： 三七;連作障礙;自毒作用;銹腐病菌;微生物降解

中圖分類號： S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0305-08

Isolation and screening of antagonistic autotoxin-degrading bacteria in Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen rhizosphere soil

WANG Luo-tao， YANG Dong-ying， DENG Lin-mei， LI Yi-wen， MA Yun-yun，

HAN Guang-yu， HUANG Hui-chuan， ZHU Shu-sheng， YANG Min*

（Key Laboratory of Agriculture Biodiversity for Plant Disease Management of Ministry of Education， Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】Isolation and screening of antagonistic saponin-degrading and rust rot resistant bacteria in the rhizosphere soil of Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen were conducted， laying foundation for developing new technology to control P. notoginseng diseases and alleviate P. notoginseng replant failure. 【Method】The bacterial strains were isolated from healthy P. notoginseng rhizosphere soil by the serial dilution method， the ability of bacterial isolates to use crude saponins as sole carbon source was tested， and their inhibition activity against Cylindrocarpon destructans RS006 was also determined by confrontation culture. The antagonistic isolate were further identified by 16s rDNA sequencing and morphology characters，the ability to degrade the main five autotoxic saponins（R1，Rg1，Re，Rb1 and Rd） after inocula-ting at different time points were evaluated using HPLC. 【Result】A total of 91 bacterial strains were isolated from P. notoginseng rhizosphere soil， among them 17 isolates were able to grow on the medium with crude saponin as the sole carbon source， and 14 isolates showed strong antifungal activity against strain RS006. Strain 41 could grow with crude saponins as sole carbon source， and had strong antifungal activity against strain RS006. According to the morphological chara-cteristics and 16S rDNA molecular identification results， the antagonistic strain No.41 was identified as Pseudomonas monteilii（PM-41）. Strain PM-41 had obvious degradation on the five autotoxic saponins（R1，Rg1，Re，Rb1 and Rd）. 【Conclusion】P. monteilii PM-41 has antagonistic activity on C. destructans and efficient degradation ability on autotoxic saponins. It has the potential prospect in controlling P. notoginseng root rot and alleviating P. notoginseng replant failure.

Key words： Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen; replant failure; autotoxicity; Cylindrocarpon destructans; microbial degradation

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31772404，31660605）; National Key Research and Development Program（2017YFD0201601）; Yunnan Universities and Colleges Innovation Team Support Plan（IRTSTYN）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen]為五加科人參屬多年生藥用植物，是我國的名貴中藥材，主要分布于云南省文山州和廣西百色地區（繆作清等，2006）。三七生長性喜溫暖陰濕，栽培年限長，種植過程中存在嚴重的連作障礙。Yang等（2015）研究表明，三七根系分泌的皂苷類化合物是造成三七連作障礙的重要誘因。目前，生產中主要通過施用化學農藥、輪作倒茬等措施緩解三七連作障礙，但農藥的大量使用不但未能明顯減輕連作障礙，而且帶來嚴重的農藥殘留和重金屬超標等藥品安全問題;同時，三七輪作期限一般需要10年以上（郭宏波等，2017）。因此，以綠色健康的防治手段緩解三七連作障礙對三七產業的健康發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】化感自毒是造成作物連作障礙的主要原因之一（Singh et al.， 1999）。游佩進（2009）通過比較三七土壤水提液和根部化合物，利用HPLC-MS分離鑒定出相同化合物人參皂苷Rh1，發現Rh1在較低濃度下對三七幼苗生長表現顯著的抑制效果;張金燕等（2017）研究發現三七土壤水提液對三七種子的萌發和幼苗生長有抑制作用。另有研究發現，三七皂苷類化合物人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1對三七幼苗萌發和生長產生不同程度的抑制（拱健婷等，2015）;一方面三七根系分泌的皂苷類自毒物質（皂苷R1、Rg1、Re、Rg2和Rd）對三七根部細胞產生明顯的損害（Yang et al.， 2015，2018），另一方面，三七皂苷提取物能明顯促進三七根腐病菌茄腐鐮刀菌、銹腐病菌和惡疫霉菌的生長（楊敏等，2014）。根際微生物與植物生長有著密切的關系。微生物作為植物的第二基因組，植物對根際微生物的影響主要是通過根系分泌物來實現（Etalo et al.， 2018）。根系分泌的小分子化合物（糖、氨基酸、有機酸、酚類及其他次生代謝產物）和大分子的蛋白和黏液等既能提供微生物生長所需的養分，又能作為信號來激活或募集微生物（Zhalnina et al.， 2018）。植物能通過募集有益微生物幫助自身抵御外界生物（病原菌的侵染、植食昆蟲的取食）和非生物（溫度、水分和鹽分等）脅迫（Chaparro et al.，2014）。植物根際土壤作為植物的一個有益菌庫，一直是國內外研究植物—微生物互作的研究熱點。王志春和孫星星（2018）從番茄根際土壤中分離到一株對番茄枯萎病菌具有較強活性的拮抗細菌，通過菌液澆灌的方式驗證其對番茄枯萎病和根腐病具有良好的防治效果。導致植物化感自毒的次生代謝產物主要有酚類化合物、萜類化合物和含氮有機物等，采用常規的物理化學方式處理很難獲得明顯的效果，且容易產生二次污染，因此微生物作為綠色高效的處理方式受到越來越多學者的關注（張曉玲等，2007）。趙東岳等（2013）從人參根際分離到5株具有高效降解人參自毒物質苯甲酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、丁二酸二異丁酯、棕櫚酸和2，2-（4-羥基苯基）丙烷的細菌。祁國振等（2016）通過分離蘋果根際土壤得到5株具有降解蘋果自毒物質根皮苷、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸和焦性沒食子酸的高效降解細菌，為緩解蘋果化感自毒作用提供了新思路。何志剛等（2017）從番茄根部分離到3株降解番茄自毒物質苯甲酸的細菌，并通過菌劑添加方式驗證了微生物菌劑緩解自毒物質對番茄幼苗的抑制?！颈狙芯壳腥朦c】已有研究表明根際微生物能降解植物分泌的自毒物質，從而緩解植物化感作用。但三七在生長過程中是否會募集有益微生物來降解代謝其分泌到根際的皂苷類自毒物質至今未見相關報道?！緮M解決的關鍵問題】利用連續稀釋法從健康三七根際土壤中分離可培養細菌菌株，進而測定細菌菌株在以粗皂苷為唯一碳源培養基的生長情況，并利用對峙培養法測定其對三七銹腐病菌的拮抗活性，在此基礎上進一步對活性菌株進行16S rDNA分類鑒定，借助HPLC評價接種活性菌株后不同時間對主要皂苷類自毒物質的降解能力，以期從三七根際土壤中分離到既可降解三七皂苷類自毒物質又能拮抗三七銹腐病菌的細菌菌株，為防治三七病害及克服三七連作障礙提供生防資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試培養基：NA培養基（蛋白胨10.00 g、牛肉浸粉3.00 g、氯化鈉5.00 g、瓊脂粉15.00 g，蒸餾水定容至1000.0 mL）;粗皂苷培養基（硝酸鈉3.00 g、磷酸氫二鉀1.00 g、七水合硫酸鎂0.50 g、氯化鉀0.50 g、硫酸亞鐵0.01 g、三七粗皂苷10.00 g、瓊脂粉15.00 g，蒸餾水定容至1000.0 mL，pH 7.2±0.2）;LB液體培養基（胰蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、氯化鈉5.00 g，蒸餾水定容至1000.0 mL）。

供試土壤：取健康三七植株，抖落根圍土壤，用無菌毛刷輕刷三七根系收集土壤，即為三七根際土壤。

供試菌株：三七銹腐病菌毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006由云南農業大學農業生物多樣性與病害控制實驗室從感病三七根部分離獲得，并通過形態學鑒定和致病性測定。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 三七根際細菌分離及純化 采用連續稀釋法分離健康三七根際土壤樣品中的細菌菌株。稱取健康三七根際土樣1 g分別置于15 mL的離心管中，加入9.0 mL無菌水，置搖床上振蕩（180 r/min）20 min，得到土壤菌懸液，靜置后將土壤菌懸液用無菌水梯度稀釋成10-2、10-3和10-4，分別取100 ?L均勻涂布在NA培養基表面，置于28 ℃恒溫箱中培養2～3 d。待菌落長出后，挑取顏色、形狀差異明顯的菌落，用無菌牙簽在NA培養基上劃線，反復劃線直至得到細菌單菌落。

1. 2. 2 三七粗皂苷提取 按Yang等（2015）的方法將自然風干的3年生三七塊根，用打粉機研磨成粉，取20 g三七粉末分別置于50 mL離心管中，用10.0 mL 80%甲醇超聲（30 ℃）提取40 min后離心（4 ℃，12000 r/min，5 min），收集上清液，下層粉末再重復提取2次，離心后合并3次上清液，將所有上清液用旋轉蒸發儀蒸發（40 ℃），待甲醇蒸發完后收集剩余液體，冷凍干燥48 h后收集三七粗皂苷固體粉末，4 ℃保存備用。

1. 2. 3 篩選以三七粗皂苷為唯一碳源生長的細菌 將上述分離純化的細菌，采用平板劃線法在以粗皂苷為唯一碳源的培養基上培養。劃線后的培養基置于28 ℃恒溫箱中培養，2～5 d后觀察粗皂苷培養基上菌株的生長情況，每株菌株設4個重復。

1. 2. 4 篩選對三七銹腐病菌有拮抗活性的細菌

采用平板對峙法測定細菌分離物對毀滅柱孢菌RS006的拮抗活性。用直徑為5 mm的打孔器在預先培養好的菌株RS006菌落邊緣打取菌餅，并放置在PDA培養基中央，在距菌餅2.5 cm的4個點上分別用無菌牙簽接種不同細菌分離物，以只接種菌株RS006的培養基為對照，每株菌株設4個重復。接種好的培養基置于25 ℃恒溫箱中培養，6～7 d后測量對照組和處理組病原菌菌落半徑，計算菌絲抑制率。

抑制率（%）=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/

對照菌落半徑×100

1. 2. 5 菌株鑒定 對篩選獲得的既能以皂苷為唯一碳源生長又對菌株RS006具有拮抗活性的細菌菌株進行形態觀察和16S rDNA鑒定。參照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對菌株進行菌落、菌體形態觀察;分子鑒定采用試劑盒OMEGA Bacterial DNA Kit提取細菌基因組DNA，采用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。擴增體系50.0 μL：27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各2.0 μL，25.0 μL 2×PCR Taq MasterMix，DNA模板2.0 μL，19.0 μL無菌去離子水。反應程序：95 ℃預變性4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物送昆明碩擎公司測序，測得序列與NCBI數據庫進行BLAST比對分析，選取相似度高的種屬確定供試細菌分離物的分類地位。在NCBI數據庫中下載相近序列，利用MAGA 7.0進行序列系統發育分析，利用Neighbor-joining算法和Jukes-Cantor模型構建系統發育進化樹。

1. 2. 6 HPLC分析活性菌株降解三七皂苷類自毒物質的能力 參照趙東岳等（2013）的方法對篩選獲得的活性菌株進行降解能力測定。用接種環挑取純化好的單一菌株，接種到50.0 mL的NA液體培養基中，置于28 ℃、150 r/min的搖床上培養過夜;取100 μL菌液加入到200.0 mL以三七粗皂苷為唯一碳源的液體培養基中（三七粗皂苷1 g/L），以不加入菌液的處理作為空白對照，置于搖床上振蕩培養（28 ℃，150 r/min），每處理設3次重復，培養96、144和192 h時分別取樣測定。

從每瓶搖培菌液中取100.0 mL液體加入等體積甲醇，搖勻，20 ℃超聲20 min，靜置5 min后取200.0 mL混合液用0.22 μm的微孔濾膜真空抽濾，將抽濾好的溶液用旋轉蒸發儀40 ℃旋轉蒸發至甲醇蒸發干;取20.0 mL溶液放入-20 ℃冰箱冷凍過夜，再放入冷凍干燥機中干燥48 h。待溶液干燥后，加入20.0 mL 70%色譜甲醇超聲溶解，充分搖勻后取10.0 mL溶液到15 mL離心管中離心（4 ℃，9000 r/min，5 min），取澄清液1.5 mL用0.22 ?m的尼龍濾膜過濾3次，濾液置于4 ℃保存備用。

利用HPLC檢測不同處理中主要皂苷物質（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的含量，并計算接菌處理中主要皂苷類自毒物質的降解率。HPLC檢測條件：色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，4 ?m，Agilent Poroshell 120 EC-C18）;流動相A：乙腈;流動相B：水;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長203 nm;進樣體積10 ?L。洗脫梯度：0～20 min，82% B;20～40 min，82%～57% B;40～48 min，57%～45% B;48～54 min，45% B;54～56 min，45%～5% B;56～71 min，5% B;71～72 min，5%～82% B;72～74 min，82% B。在此條件下，可實現5種主要皂苷達到基線分離。

降解率（%）=（未接菌培養液的皂苷含量-接菌

培養液皂苷含量）/未接菌培養液

的皂苷含量×100

1. 3 統計分析

利用Excel 2013進行數據處理，運用SPSS 19.0中的Duncans新復極差法進行方差分析。

2 結果與分析

2. 1 三七根際土壤細菌分離結果

從NA培養基上挑選顏色或形態特征具有差異的微生物，經劃線純化后獲得細菌分離物91株。將91株細菌分離物保存于LB-甘油中（甘油終濃度40%），置于-20 ℃保存備用。

2. 2 三七粗皂苷降解細菌篩選結果

由表1可知，91株細菌分離物中有17株能以三七粗皂苷為唯一碳源生長，分別是菌株1、3、21、41、42、43、50、51、52、53、54、57、58、63、64、70和71，其余74株細菌不能利用三七粗皂苷生長。由此可見，三七根際細菌中大多數細菌不能利用三七皂苷為唯一碳源生長，僅有少數細菌可能具有降解三七皂苷類自毒物質的能力。

2. 3 對三七銹腐病菌具有拮抗活性菌株篩選結果

平板對峙培養試驗結果（表2）表明，對菌株RS006具有抑制作用的菌株有14株，其中抑制率大于50.00%的有4株，分別為菌株17、24、36和46;大多數菌株對菌株RS006的抑制率在30.00%～40.00%，包括菌株32、41、42、49、53、65、81和91;菌株18和70的抑制率在20.00%～30.00%。

2. 4 拮抗菌株鑒定結果

由表1和表2可看出，菌株41既能以三七粗皂為唯一碳源生長，又對菌株RS006具有較強的抑制活性，因此進一步對菌株41進行形態觀察和16S rDNA分子鑒定。

菌落形態觀察結果（圖1-A）顯示，菌株41在NA培養基上生長48 h后形成白色圓形小菌落，菌落表面光滑隆起，邊緣不規則，不透明;由革蘭氏染色結果（圖1-B）可知，菌株41革蘭氏染色呈陰性，菌體呈短桿狀，無芽孢。

將菌株41得到的序列輸入NCBI數據庫進行BLAST比對分析，結果顯示，菌株41與蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）相似性最高，為98.35%，GenBank登錄號G0V375SV014。利用MEGA7.0構建的系統發育進化樹（圖2）顯示，菌株41與蒙氏假單胞菌CIP 104883（登錄號NR 024910.1）位于同一分支，說明二者的親緣關系最近，且與假單胞菌屬的其他種能明顯分開。綜合菌株41的形態特征和16S rDNA分子鑒定結果，將菌株41鑒定為蒙氏假單胞菌，將其編號為PM-41。

2. 5 HPLC檢測蒙氏假單胞菌PM-41對皂苷類自毒物質的降解能力

由表3可知，菌株PM-41對三七粗皂苷中5種主要皂苷類自毒物質R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均具有較強的降解活性，隨著接種時間的延長，皂苷R1在4個時期的濃度均存在顯著差異（P<0.05，下同）;皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd在接種0 h與接種96 h間差異不顯著（P>0.05，下同），但濃度有所降低，而在接種144和192 h后，4種皂苷的濃度顯著降低（皂苷Rd在接種144和192 h后濃度低于96 h時的濃度，但差異不顯著）。結合降解率分析可知，5種皂苷在接種菌株PM-41 96～144 h出現明顯降解，可推斷這5種皂苷的主要降解時間為96～144 h。在培養后期（144～192 h），皂苷Rb1和皂苷Rg1的降解率趨于平緩;皂苷Re和皂苷Rd的降解率仍表現持續上升的趨勢，可能還存在降解;而皂苷R1濃度出現先降低后升高的趨勢，可能與皂苷之間的轉化有關（許歡等，2017）。

3 討論

本研究從健康三七根際土壤中分離到91株細菌，并從中篩選獲得一株既能在以三七皂苷為唯一碳源的培養基上生長，又對毀滅柱孢菌具有明顯拮抗活性的蒙氏假單胞菌菌株PM-41，HPLC測定結果顯示菌株PM-41對5種主要三七自毒皂苷類化合物R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均具有較好的降解效果，為緩解三七連作障礙提供了新思路。

通過微生物降解環境中的有毒物質，已成為當前的研究熱點。環境科學中，通過微生物降解土壤中的苯酚、DDT和多環芳烴類化合物已得到廣泛應用（賀強禮等，2016;馮玉雪等，2018）。以生物降解的方式進行有害物質降解，一方面可避免物理化學處理過程中可能存在的二次污染問題，另一方面，微生物降解效率比常規方法高，而且更環保（周開勝，2017）。在農業生產方面，已有研究顯示，微生物能有效降解植物通過根系分泌到根際土壤中的自毒物質，如苯甲酸、根皮苷、鄰苯二甲酸二異丁酯、丁二酸二異丁酯、棕櫚酸和2，2-（4-羥基苯基）丙烷等（黃園勇等，2013;趙東岳等，2013;劉紫英等，2018;聶園軍等，2018）。

假單胞菌屬（Pseudomonas）作為土壤及植物中廣泛存在的生防菌，在幫助植物抗病、促生，聯合固氮解鉀，降解植株內的農藥殘留和抵御重金屬脅迫等方面均具有顯著的效果（張暉等，2015;劉丹丹等，2016;張春花等，2017;代志和高俊明，2018）。袁蓮蓮等（2017）研究發現，利用蒙氏假單胞菌對受TMV污染的煙草幼苗進行生物鈍化，表現出明顯的效果;此外，蒙氏假單胞菌對煙草產生的煙堿也有明顯降解效果（李陽等，2015）。蒙氏假單胞菌作為五味子中的內生細菌，對人參銹腐菌表現出較強的拮抗效果（徐麗等，2009）。

土壤環境復雜多變，土壤微生物多樣性豐富，再加之土壤微生物間復雜的相互作用組成了土壤環境復雜的生態網絡。已有研究表明，單一的微生物添加難以在復雜的土壤環境中定殖生存（Xu et al.， 2019）。微生物的相互作用關系復雜多樣，且微生物間存在代謝物相互利用的情況（Berendsen et al.， 2018）。因此，嘗試以多種微生物組合的形式添加到土壤中（Duran et al.， 2018），形成穩定的微生物菌群，更能有效發揮有益微生物的作用。本研究后續將從菌群構建的角度出發，以分離到的降解細菌為出發點，篩選出更多的高效降解微生物，并通過菌群組合的方式，提高微生物菌群的降解能力，進一步緩解三七的連作障礙。

4 結論

從三七根際土壤分離獲得的蒙氏假單孢菌菌株PM-41既能有效降解三七皂苷類自毒物質，對引起三七根腐的毀滅柱孢菌也具有較強抑制活性，具有防治三七銹腐病和緩解三七連作障礙的生防潛力。

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