葡萄糖氧化酶在枯草芽孢桿菌芽孢表面的展示及其酶電極制備

林平，宋龍祥，常德軍，馬耀宏，王騰飛

1 齊魯工業大學 (山東省科學院) 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353

2 齊魯工業大學 (山東省科學院) 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353

3 齊魯工業大學 (山東省科學院) 生物研究所山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250103

葡萄糖-1-氧化酶 (Glucose oxidase，GOD)(β-D-葡萄糖氧化還原酶，EC 1.1.3.4) 是一種重要的糖蛋白，由2個相同的80 kDa亞基和2個黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔酶組成。在有氧條件下，能夠以分子氧為電子受體，將葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過氧化氫。GOD主要生產菌株為黑曲霉和青霉，由于其氧化能力，顯示出較高的酶穩定性，因此與其他酶相比，GOD在酶電極中起著主導作用[1-2]。但是，在電極的固定化過程中需要酶的純化，這增加了成本，并且已成為固定化酶電極開發領域的瓶頸[3]。另外，常規的物理或化學固定方法經常導致酶活性損失、酶泄漏和傳質阻抗[4]。

近幾年，隨著微生物表面展示技術的不斷發展，實現了微生物表面展示酶與酶電化學生物傳感器的結合。在傳感器的發展中，純度較高的商品酶應用較多，但由于其制備和提取工藝極其繁瑣，使得酶的成本增加，這也就限制了商品酶生物傳感器的使用范圍。通過微生物表面展示技術，將外源蛋白展示在微生物表面，有利于提高酶的熱穩定性和pH耐受性[5-8]。相比于商品酶，展示在微生物表面的酶不需要復雜的制備工藝，容易獲取，節約成本。因此，微生物表面展示技術與酶電化學生物傳感器的結合是一種必然趨勢。隨著完成枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis基因組的測序工作，B.subtilis芽孢表面已成功展示了多種外源蛋白，并因該菌株為安全菌株，無內毒素，在許多生產領域備受認可，如食品與醫藥、水質凈化、飼料生產等領域[9-11]。構建B.subtilis芽孢表面表達體系時，以芽孢衣殼蛋白為錨定蛋白，將外源蛋白融合展示在芽孢表面，因為芽孢是在細菌細胞質中合成的，所以外源蛋白的表達都不需要穿過任何膜，并且芽孢能抵抗惡劣的環境條件，有利于提高外源蛋白質在復雜環境中的使用穩定性[12-14]。發酵得到的重組芽孢可以直接用于電極修飾，避免因細胞破碎、雜質分離造成的成本增加。

氧化石墨烯 (Graphene oxide，GO) 是石墨烯的氧化物，其片層上有大量的羥基和羧基活性基團[15]，含氧官能團隔開了石墨烯共軛自由基團，使氧化石墨烯具有良好的親水性和機械性能[16]，而且為固定生物分子提供表面修飾活性位置和較大的比表面積，在電化學傳感器中還起到了信號放大的作用[17]。普魯士藍 (Prussian blue，PB) 在低電位下可以迅速催化還原H2O2，因此，又被稱為“人工過氧化物酶”[18-19]。同時使用GO材料和PB電子媒介體構建葡萄糖酶生物傳感器，有利于增強生物傳感器的靈敏度，這是因為GOD催化葡萄糖產生的H2O2能接著被PB還原[19-20]。聚四氟乙烯 (Nafion) 能將酶包埋在聚合物材料的網格或微膠囊結構中，防止酶的滲漏，而對應的底物可以通過網格與Nafion內部包埋的酶接觸使催化反應正常進行，這樣幾乎不改變活性物質的高級結構，因而不破壞酶的生物活性[21]。

本研究以枯草芽孢桿菌為宿主菌，構建了芽孢展示GOD的重組菌，利用GO材料、PB電子媒介體構筑了一種新型葡萄糖電化學生物傳感器。通過Western blotting、免疫熒光分析以及酶活檢測等手段證明GOD成功在芽孢表面展示并有效表達，同時還研究了所制備的基于芽孢表面展示GOD構筑的葡萄糖電化學生物傳感器的各種影響因素、傳感器的檢測方法以及性能參數。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

pDG1730質粒 (含amyE基因上下游同源臂)購自山東沃森生物科技有限公司。pET28a-god質粒實驗室保存。感受態細胞大腸桿菌Escherichia coliDH5α購自南京諾唯贊生物科技有限公司。B.subtilisWB800n為實驗室保存菌株，為cotX基因的來源菌株，也是外源蛋白的表達宿主菌。

1.1.2 培養基與實驗試劑

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒、細菌基因組抽提試劑盒、質粒提取試劑盒購于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。限制性核酸內切酶BamHⅠ和HindⅢ、2×Phanta Max Master Mix等工具酶購自賽默飛公司。無縫克隆試劑盒、核酸分子量Marker(DL5000)、蛋白分子量Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司。BSA、山羊血清、BCA蛋白濃度測定試劑盒、FITC-羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG購自博士德生物工程有限公司。Anti-GODZ antibody購自英國Abcam公司。5 wt%Nafion購自Sigma-Aldrich公司。氧化石墨烯 (GO)購自南京吉倉納米科技有限公司。D-(+)-葡萄糖購買于國藥集團化學試劑有限公司。0.1 mol/L PBS(pH 7.0) 實驗室自制。

LB (Luria-Bertani medium) 培養基(W/V):1%NaCl、0.5%酵母浸粉、1%蛋白胨；LB固體培養基在液體培養基中加入1.5%–2%瓊脂粉即可；LB淀粉培養基在LB培養基中添加1%淀粉即可，用于檢測淀粉酶酶活。

DSM (Difico sporulation medium)：0.8% (W/V)營養肉湯，0.1% KCl，0.025% MgSO4?7H2O，1 mmol/L Ca(NO3)2，0.01 mmol/L MnCl2，0.01 mmol/L FeSO4。

普魯士藍沉積液配制方法：用二次蒸餾水配制2.5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液，記為A液；2.5 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L KCl，0.2 mol/L HCl溶液，記為B液；以及0.1 mol/L EDTA-Na2溶液，記為C液。使用時4.5 mL的A液、4.5 mL的B液和1 mL的C液混合。

1.1.3 主要儀器

DNA擴增儀 (美國ABI)；水平電泳槽、蛋白質電泳儀 (北京六一儀器廠)；濕式轉印槽 (北京君意)；超聲波破碎儀 (新芝生物科技股份有限公司)；高速冷凍離心機 (Eppendorf)；生物電泳凝膠成像分析系統 (北京賽智創業科技有限公司)；激光共聚焦顯微鏡 (德國Leica) 等。電化學測量法是在CHI760D電化學分析儀 (中國上海辰華儀器公司) 完成的。臺式掃描電子顯微鏡；高速冷凍離心機 (Eppendorf)；電子分析天平；KQ3200DE型數控超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

使用特異性引物cotX-BamHⅠ-F和cotX-R從B.subtilisWB800n菌株基因組DNA中擴增克隆芽孢衣殼蛋白基因cotX；使用特異性引物god-F和god-Hind Ⅲ-R，以pET28a-god質粒為模板擴增目的基因god(序列見表1)。將得到的PCR產物通過多片段無縫克隆技術連入經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的pDG1730質粒中，得到重組質粒pDG730-cotX-god，通過化學轉化法轉入B.subtilisWB800n感受態細胞，構建重組菌B.subtilisWB800n-cotX-god。

表1 本研究中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組芽孢的制備

利用饑餓法在DSM (Difico sporulation medium) 培養基上誘導重組菌產生芽孢。取重組菌落點接5 mL LB (含壯觀霉素，工作濃度為100 μg/mL) 液體培養基 中，37 ℃過夜培養，然后在含壯觀霉素 (工作濃度為100 μg/mL) 的50 mL DSM中接入1% (V/V) 的菌液，37 ℃、200 r/min搖床培養96 h。培養結束后的菌體8 000 r/min離心20 min，除去上清，用無菌去離子水將沉淀洗滌2次，最后得到重組芽孢[22]。

1.2.3 重組芽孢Western blotting分析

提取重組菌B.subtilisWB800n-cotX-god芽孢表面總蛋白，采用SDS-PAGE分離蛋白質樣品[23]，分離后的蛋白用濕轉法從凝膠上轉移到PVDF膜上，再用封閉液室溫下封閉1 h，將膜上封閉液洗凈后，把膜置于一抗 (Anti-GODZ antibody) 中，4 ℃條件下孵育12 h，將一抗回收，用TBST把膜洗3次，每一次振蕩洗滌5 min。再用對應的二抗稀釋液與膜接觸，于室溫下孵育1 h，同樣回收二抗，用TBST洗膜3次，每次10 min，化學發光反應后掃描[24]。

1.2.4 重組芽孢免疫熒光分析

將制得的重組芽孢加入適量一抗 (Anti-GODZ antibody)，置于冰上2 h，用抗體結合緩沖液洗滌離心盡量除去上清，再向其中加入由PBS適當稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG (二抗)，置于冰上2 h，反應結束后，再用抗體結合緩沖液洗滌離心，將適量芽孢懸液滴涂在載玻片上，蓋上蓋玻片，在室溫避光的環境中將其吹干，用熒光顯微鏡觀察[25]。

1.2.5 芽孢表面展示GOD的酶活分析[26]

一個酶活力單位為：30 ℃、pH 6.0的磷酸鹽緩沖體系下，每分鐘催化1 μmol/L葡萄糖轉化為葡萄糖酸的酶的量。

取20 g/L的葡萄糖磷酸緩沖溶液25 mL于錐形瓶中，在30 ℃恒溫水浴中預熱3 min，加入樣品，混勻后立即計時反應，準確反應60 min后立即加入0.1 mol/L的NaOH溶液20 mL，混勻終止反應，加入1滴酚酞，用0.1 mol/L的HCl標準溶液進行滴定，記錄消耗HCl的體積V。

空白對照：用水代替酶液，其余步驟相同，消耗HCl標準溶液體積為V0。

計算：GOD(U/g)=(V0?V)×C×N×1 000/(60×m)。

式中，C為HCl標準溶液的準確反應濃度；N為酶液的稀釋倍數；1 000為換算系數；60為反應時間，單位為min；m為菌體干重。

1.2.6 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE修飾電極的制備

將預處理玻碳電極表面快速晾干，向電極工作面滴涂5 μL氧化石墨烯溶膠，電極記作GO/GCE。晾干后浸入PB沉積儲備溶液中進行PB沉積，沉積方法為循環伏安法，沉積條件為電壓?0.2–0.6 V，掃描速度50 mV/s，掃描圈數50圈。以去離子水充分清洗工作電極表面，晾干后向工作面滴涂5 μL的Spore-GOD懸液，置于4 ℃冰箱晾干，最后滴加5 μL的0.5 wt% Nafion溶液，晾干，修飾電極記作Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE，其制作方法和原理如圖1所示。

圖1 電極的制作過程及作用原理示意圖[27]Fig.1 Schematic diagram of electrode fabrication process and catalytic reaction mechanism[27].

2 結果與分析

2.1 重組枯草芽孢桿菌的PCR驗證

將重組質粒pDG1730-cotX-god轉入B.subtilisWB800n感受態細胞中，得到可以表達GOD的轉化子。PCR驗證表明擴增得到2 500 bp左右的目的片段 (圖2)，與理論值相同。未轉質粒的B.subtilisWB800n沒有出現相應的條帶，說明重組質粒已經成功轉入。

圖2 重組菌B.subtilis WB800n-cotX-god的PCR驗證Fig.2 PCR validation of recombinant B.subtilis WB800n-cotX-god.1:5 000 bp DNA marker;2–6:B.subtilis WB800n-cotX-god ;7:B.subtilis WB800n.

2.2 芽孢表面展示GOD的Western blotting分析

提取B.subtilisWB800n-cotX-god芽孢衣殼總蛋白后，Western blotting分析結果見圖3。圖中得到的82 kDa左右的特異性條帶表明重組芽孢表面成功展示了葡萄糖氧化酶。

圖3 重組菌B.subtilis WB800n-cotX-god的芽孢表面融合蛋白Western blotting分析圖Fig.3 Western blotting analysis of spore surface fusion enzyme of recombinant B.subtilis WB800n-cotX-god.

2.3 芽孢表面展示GOD的IF分析

取陽性轉化子B.subtilisWB800n-cotX-god的芽孢以及B.subtilisWB800n的芽孢進行了IF分析，圖4A中可以看到，對照菌B.subtilisWB800n的芽孢在紫外光的激發下沒有出現熒光，而圖4B中B.subtilisWB800n-cotX-god的芽孢表面可以看到紅色熒光，表明外源蛋白GOD已經成功展示在芽孢表面。

圖4 免疫熒光分析圖 (A:B.subtilis WB800n免疫熒光分析；B:B.subtilis WB800n-cotX-god免疫熒光分析)Fig.4 Immunofluorescence analysis of B.subtilis WB800n (A) and B.subtilis WB800n-cotX-god (B).

2.4 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE修飾電極的表征

SEM被用于表征GO，GO/PB和Spore-GOD/GO/PB等材料的形態和分散情況。圖5A中GO表面具有褶皺，這種自然的褶皺對保持GO具有高的比表面積非常有利，有利于生物材料的吸附。圖5B為芽孢包埋在GO/PB復合材料表面的SEM，圖中可觀察到PB納米顆粒自由分散在GO表面，且GO表面的褶皺使芽孢更穩定存在電極表面。

圖5 電極SEM表征圖 (A:GO;B:Spore-GOD/PB/GO)Fig.5 SEM characterizations of GO (A) and Spore-GOD/PB/GO (B).

2.5 修飾電極的電化學表征

循環伏安法 (CV) 被用以表征Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE電極的修飾過程，裸玻碳電極、GO/GCE電極和Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE電極都是在0.20 mol/L的KNO3溶液中記錄10–3mol/L K3Fe(CN)6溶液的循環伏安曲線。如圖6A所示，將GO滴在裸玻碳電極表面后，峰電流有所增加，這是因為GO具有導電能力，可促進電子傳遞。但是修飾電極Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE的峰電流較GO/GCE的降低了，這是由于Spore-GOD不導電，阻止了電子向電極表面的傳遞。

交流阻抗法 (EIS) 也是表征修飾電極的方法之一。如圖6B所示，圖譜中的半圓大小表明了電極的阻抗大小，其中GO/GCE修飾電極的半圓最小，阻抗最低，因為電極表面的GO可以促進電子傳遞，使該電極的阻抗小于裸玻碳電極；而修飾電極Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE的阻抗值最大，這是因為大量芽孢阻礙了電子的傳遞。由EIS得到的結論與CV一致。

圖6 不同修飾電極的CV圖和EIS圖 (A：不同修飾電機的CV圖；B：不同修飾電極的EIS圖)Fig.6 CVs (A) and EIS (B) of different modified electrodes.

2.6 pH和溫度對傳感器的影響

影響生物傳感器響應特性的因素主要有測試溶液的pH值和溫度?？疾霳afion/Spore-GOD/PB/GO/GCE傳感器在pH 2.5–10范圍內對1 mmol/L葡萄糖溶液的電流響應，結果如圖7所示。在pH小于7范圍內，隨著pH的增大電流值也增大；在pH為7時，電流響應最大；pH大于7.0時，電流響應呈下降趨勢。所以本研究選擇pH 7.0的PBS作為檢測溶液。

圖7 溶液pH值對電流響應的影響Fig.7 Effect of solution pH on current response.

實驗還考察了測試溫度 (在20–70 ℃范圍內)對傳感器的影響。結果如圖8所示，溫度在20–40 ℃范圍內時，隨著溫度的升高，傳感器的電流響應值也會增大；溫度在40 ℃時，電流值達到最大；溫度大于40 ℃時，電流值開始下降。因為考慮到過高的溫度會使酶失去活性而影響實驗的準確性和實驗過程中操作的方便性，所以選擇室溫25 ℃作為檢測溫度。

圖8 溶液溫度對電流響應的影響Fig.8 Effect of solution temperature on current response.

2.7 傳感器的性能研究

為了進一步檢測Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE修飾電極的工作性能，采用循環伏安法研究了修飾電極的檢測線性范圍。

如圖9所示，Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE電極對葡萄糖的響應良好，電極峰電流隨著底物濃度的增加而逐漸增大，在0.1–7.0 mmol/L的葡萄糖濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.992 9。信噪比為3時 (S/N=3)，根據3 σ規則計算可得葡萄糖的檢測下限為7.5 μmol/L，靈敏度為41.55 μA·L/(mmol·cm2)。因此，人體的空腹血糖濃度 (空腹血糖的正常范圍為3.89–6.11 mmol/L)在酶電極的線性范圍內，可適用于人體血液中葡萄糖的直接檢測。該生物傳感器性能優于其他文獻報道的用于葡萄糖檢測的傳感器，Zhang等[28]通過將MnO2納米線修飾玻碳電極，并將GOD固定在其表面制得葡萄糖生物傳感器，線性范圍為0.2–3.8 mmol/L，檢出限為25.56 μmol/L，靈敏度為38.2 μA·L/(mmol·cm2)；Zhao[29]在聚苯胺修飾的玻碳電極 (PANI/GCE) 上進行了GOD的固載，制得的傳感器線性范圍為0.5–2.25 mmol/L；Wang等[30]制備的用于葡萄糖檢測的ZnO納米梳生物傳感器其檢測限為20 μmol/L，靈敏度為15.33 μA·L/(mmol·cm2)。

圖9 傳感器對不同濃度葡萄糖溶液的催化響應圖Fig.9 Catalytic response of the sensor to glucose solutions with different concentrations.

2.8 傳感器的抗干擾性、重現性和穩定性

實驗主要考察了抗壞血酸 (AA) 和尿酸(UA) 是否會對傳感器Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE產生干擾，在待檢測的1.0 mmol/L葡萄糖溶液里加入1.0 mmol/L抗壞血酸，1.0 mmol/L尿酸，葡萄糖的電流響應沒有明顯的變化。說明該傳感器的抗干擾能力良好。

Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE傳感器的穩定性和重復性。通過將Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE置于0.1 mmol/L葡萄糖溶液中進行循環伏安掃描50圈，比較氧化峰電流，考察傳感器的穩定性，得到電流值比最初電流增加了約5%，說明傳感器具有很好的穩定性和可重復性。用同樣的方法分別制備了5根Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE傳感器，測定同一份0.1 mmol/L葡萄糖溶液，電流值的相對標準偏差 (Relative standard deviation，RSD) 為4.2%，這表明傳感器的制備方法具有較好的重現性。不使用時將該電極保存在4 ℃冰箱內，用該電極每天測定0.1 mmol/L葡萄糖溶液，在1–10 d內電流強度保持平穩，未出現大幅度波動情況，10 d后電峰電流強度有所下降，這表明所制備的電極在10 d內具有一定的穩定性。

2.9 傳感器在實際樣品中的應用

為描述該傳感器在實際分析中的可行性，將該傳感器用于實際血清中的葡萄糖檢測。為適應該生物傳感器的檢測范圍，提高檢測準確度，在檢測前將血樣用0.1 mol/L PBS (pH 7.0)適當稀釋，每個樣品同時檢測3次。從表2可知，傳感器的回收率好，這表明構建的電極具有實際應用的可能性。

表2 實際樣品中葡萄糖含量的檢測Table 2 Determination of glucose content in actual samples

3 總結

利用重組芽孢以及GO材料和PB電子媒介體構筑的新型葡萄糖電化學生物傳感器性能優良，主要原因可能是：通過枯草芽孢桿菌芽孢表面展示GOD，芽孢優良的抗逆性可有效提高外源蛋白GOD的穩定性，從而有利于修飾電極的應用和穩定儲存；在電極構建過程中引入Nafion溶液可以改善檢測過程中酶的滲漏問題，使得傳感器的穩定性提高；GO-PB中的PB可以和Spore-GOD形成擬雙酶體系，使得信號放大，從而增強了生物傳感器的靈敏度；電極制備過程溫和，具有很好的生物兼容性，可以有效地保持酶的構型和活性。

葡萄糖參與生命體代謝，是生命體能量的重要來源，對人體內血糖含量的測定有利于疾病的診斷和預防。葡萄糖氧化酶是工業生產和醫學檢測中的一種重要用酶，但是由于酶分子的活性中心深埋其內部、直接吸附在電極表面容易變形和污染等原因，大大限制了葡萄糖氧化酶電極的進一步發展。本研究利用枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術將GOD展示到芽孢表面，可直接發酵獲取大量重組芽孢，避免了細胞破碎引起的污染及酶的純化成本問題，具有一定的應用價值。將GO/PB復合膜修飾玻碳電極制成電化學傳感器用于葡萄糖的靈敏測定。此修飾電極具有良好的導電性能、催化性能、穩定性和重現性，可適合于檢測人體血糖濃度。