幼鼠非酒精性脂肪性肝炎模型的建立及其肝纖維化特征的研究

武楠，王曉曉，費然，饒慧瑛，魏來，劉峰

（1.北京大學人民醫院，北京大學肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點實驗室，北京 100044；2.清華大學附屬北京長庚醫院肝膽胰中心，北京 102218）

近年來，兒童非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病率逐年升高，已成為全球共同關注的公共衛生問題之一［1-5］。中國兒童疑似NAFLD患病率為9.03%［5］。兒童脂肪肝不僅本身是一種潛在的進展性疾病，而且可以同時或者在成年后并發多種嚴重疾病，特別是糖尿病及心血管疾病，嚴重威脅其當前和成年后的健康甚至生命［6-8］。因此，必須早防早治，避免脂肪肝向惡性結局進展。NAFLD疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關肝纖維化和肝硬化。但目前兒童NAFLD的發病機制仍不明確，故迄今為止沒有有效的藥物治療方案［9-12］。因此，建立合適的動物模型對于研究兒童NAFLD的發病機制、改善診斷以及有效地預防和研究各種藥物的治療作用意義重大。

NAFLD動物模型主要有飼料誘導模型（高脂飲食等）、基因修飾型模型（PTEN缺陷小鼠模型等）、復合性模型（聯合飲食和基因誘發模型等）［13-14］。飼料誘導的脂肪肝模型操作方法簡便，價格低廉，重復性好，死亡率低，是國內外最常用的造模方法。但是目前以上這些營養模型僅在成年動物身上重現（最常見的喂養開始時間為6～8周齡），對于幼齡小鼠的研究報道較少，因此，建立合適的動物模型對于研究兒童NAFLD/NASH的發病機制和新藥研發意義重大。故本研究擬開發表征能夠與兒童NASH發展背景的一致的幼年動物模型，以期為研究兒童NAFLD/NASH提供合適的動物模型。同時，本研究擬利用二次諧波（second harmonic generation，SHG）/雙光子激發熒光（two photon excited fluorescence，TPEF）顯微成像技術自動化評估幼鼠模型肝纖維化進程中膠原的變化特點。

1 材料與方法

1.1 材料

3周齡、4周齡、5周齡和6周齡雄性C57BL/6小鼠，SPF級，購自北京維通利華公司。蛋氨酸膽堿缺乏飼料（methionine-and choline-deficient diet，MCD）購自江蘇美迪森公司，普通飼料購自北京維通利華公司。HE染色和天狼猩紅染色試劑盒購自北京益利精細化學品有限公司。本研究方案經由北京大學人民醫院動物倫理委員會審批（批號：2018PHC026），符合實驗動物管理與使用準則。

1.2 動物分組及模型制備

將3、4、5、6周齡小鼠隨機分為MCD誘導組和正常飲食對照組。分別在造模0周、4周、6周和8周時處死動物（每個時間點6只），留取血清及肝組織標本。

1.3 血清生化指標檢測

采用全自動生化分析儀測定肝功能指標血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）。

1.4 肝組織病理學

用4%多聚甲醛固定肝組織，經脫水、透明、石蠟包埋，制組織切片（厚度4 μm）。常規行HE染色和天狼猩紅染色。光學顯微鏡下觀察肝組織學變化，參照NASH臨床研究網絡（Clinical Research Network，CRN）分期［15］，將肝組織纖維化分為4期（S0～S4）。

1.5 肝組織膠原量化分析

將組織切片脫蠟后，使用SHG/TPEF顯微成像設備（Genesis，新加坡Histoindex公司）成像后，軟件自動提取并分析100個膠原蛋白參數（包括膠原總定量和不同分區的膠原，如匯管區、中央靜脈區和肝小葉）。以造模后不同時間點和不同纖維化分期為標準，進一步采用支持向量機（support vector machine，SVM）算法對樣本數據進行分析。

1.6 統計學分析

采用SPSS 10.0軟件繪制生存時間Kaplan-Meier曲線，比較采用log-rank檢驗。計量資料以±s表示，多組間均數比較采用One-Way ANOVA檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同周齡小鼠MCD誘導后的一般狀況

正常飲食對照組不同周齡小鼠體質量逐漸升高；而MCD誘導組不同周齡的小鼠體質量逐漸下降，見圖1。隨著喂養時間延長，正常飲食對照組不同周齡小鼠無死亡，而MCD誘導組小鼠死亡數量增加，各周齡小鼠8周存活率不同，其中3周齡組最低（37.5%），4、5、6周齡組分別為62.5%、87.5%和87.5%，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖2。

2.2 不同周齡小鼠MCD建模后相關生化學指標

與正常飲食對照組相比，隨著MCD誘導時間的延長，3、4、5、6周齡MCD誘導組的小鼠ALT和AST水平均逐漸升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

2.3 不同周齡小鼠MCD誘導后肝組織病理學表現

圖2 不同周齡小鼠MCD飲食和普通飲食后的生存曲線Fig.2 The survival curve of mice of different ages after administration of MCD diet and normal diet

正常飲食對照組小鼠肝組織結構正常，偶有脂肪變。不同周齡MCD誘導組模型小鼠在MCD飲食4周時即可見肝內脂肪變和散在的炎癥，其中以3周齡組脂肪變和炎癥明顯，并且隨著造模時間的延長，各組肝小葉內脂肪變和炎癥逐漸加重。同時可見肝內膠原量逐漸增多，肝纖維化進展，見圖4。提示3～6周齡各組小鼠在MCD誘導8周后均出現NASH的病理特征。

2.4 不同周齡小鼠MCD誘導后膠原參數特征

用SHG/TPEF顯微成像技術分析肝組織內100個膠原參數，包括16個膠原總特征、28個匯管區膠原特征、28個中央靜脈區膠原特征、28個肝小葉內的肝竇周膠原特征。對MCD誘導后的不同時間點（0、4、6、8周）進行分析發現，與6周齡組比較，3、4、5周齡組小鼠肝臟膠原分布存在相似性，匯管區膠原量明顯高于6周齡組，而中央靜脈區和竇周膠原量明顯低于6周齡組；各組16個膠原總特征的指標無顯著差異，見圖5。

各組肝組織纖維化評分結果顯示，最大評分為2分，3周齡組偶有3分，同樣，隨著纖維化分期加重，3周齡、4周齡和5周齡組的膠原分布存在相似性，匯管區的膠原量明顯高于6周齡組，而中央靜脈區的膠原和竇周膠原量明顯低于6周齡組；各組16個膠原總特征的指標無顯著差異，見圖6。

3 討論

圖3 MCD或普通飲食0～8周后不同周齡小鼠的ALT和AST水平Fig.3 The ALT and AST level of mice of different ages after administration of MCD diet and normal diet for 0 to 8 weeks

近年來，兒童NAFLD患病率顯著增高。建立合適的反映兒童NAFLD特征的動物模型，對研究兒童NAFLD的發病機制、藥物的篩選等有重要價值。MCD飲食所誘導的肝臟脂肪變性炎癥及纖維化等組織病理特征與人類NASH相似，是公認的NASH模型［11］，已廣泛用于NASH發病機制的研究。本研究發現，從離乳3周齡幼鼠到6周齡成鼠，MCD誘導后ALT和AST均升高，肝損傷加重，病理上均可觀察到脂肪變、炎癥和纖維化，提示小鼠NASH模型建立成功。

研究［16-19］表明，SHG/TPEF顯微成像技術可以對不同纖維化動物模型、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及NAFLD患者的肝臟組織內膠原成像和定量，并可以對肝纖維化的膠原特征進行分析。本研究中進一步比較了MCD飲食誘導不同周齡小鼠NASH模型的纖維化情況，發現3周齡、4周齡和5周齡幼鼠的MCD模型不同分期和不同時間點的肝纖維化變化有相似性，其匯管區的膠原量明顯高于6周齡組，而中央靜脈區的膠原和竇周膠原量明顯低于6周齡組。SCHWIMMER等［20-23］將兒童NASH分為2種模式，即1型（成人型）和2型（兒童型）。成人型NASH中，脂肪變性、小葉炎癥和竇周纖維化有關；兒童型NASH中，脂肪變性不局限于某一特定區域，而是更廣泛地分布，且炎癥和纖維化的主要部位在匯管區，兒童型通常出現于兒童NASH患者。本研究中對3周齡、4周齡和5周齡幼鼠的纖維化分析結果與兒童型NASH纖維化類似，以匯管區膠原改變為主；6周齡小鼠的纖維化分析結果與成人NASH纖維化類似，以竇周和中央靜脈周纖維化為主。進一步從纖維化特征方面提示3周齡、4周齡和5周齡幼鼠適合建立兒童NASH模型。然而，這些兒童和成人NASH的病理差異是否源于這2種類型發育過程中的特定機制尚不確定。

圖4 不同周齡小鼠MCD建模不同時間點HE和天狼猩紅染色圖像 ×200Fig.4 The HE and sirus red staining image of mice of different ages after administration of MCD diet at different weeks ×200

圖6 不同周齡小鼠MCD建模不同纖維化分期的膠原分布特征Fig.6 The collagen features of mice of different ages at different fibrosis stage after administration of MCD diet

同時，本研究中也觀察到MCD飲食的的缺點是小鼠體質量下降，3周齡組幼鼠MCD飲食至8周時，存活率只有37.5%。提示如果要觀察NASH進程及進行機制的分析，需綜合考慮存活率和病理特征。

綜上所述，本研究發現MCD誘導的3周齡、4周齡和5周齡幼鼠的病理特征與兒童型NASH類似，可為兒童NAFLD的發病機制、診療和防治提供合適的動物模型。