miR-146a、miR-25和CysC在妊娠期高血壓合并腎功能損害中的診斷價值

劉琴 彭珊珊

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，常對腎臟、心臟、肝臟和腦造成損害，其中首先受到損傷的臟器為腎臟，往往導致母嬰的嚴重后果[1]。早期評價妊娠期高血壓疾病合并腎功能損害，早期采取治療措施，是降低母嬰風險的關鍵[2]。有研究證實妊娠期高血壓疾病發生與多種基因存在密切聯系，并且有遺傳背景的孕婦發生率更高[3]。有研究認為微小RNA(miRNA)是參與了高血壓腎病的發生發展過程[4，5]，miR-146a和miR-25研究組證實參與了動脈粥樣硬化和高血壓腎病的病理生理過程[6，7]，而是否參與了妊娠高血壓疾病患者的腎臟損害筆者尚未見報道。血清胱抑素(CysC)已經被證實較為準確評估腎小球濾過率，是評價腎臟功能損害的傳統指標[8]。本研究通過聯合檢測血清miR-146a、miR-25和CysC觀察在檢測妊娠高血壓疾病患者診斷腎功能損害中的臨床意義，結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2018年12月在上海中醫藥大學附屬第七人民醫院就診的妊娠高血壓疾病患者76例，為妊娠期高血壓疾病組，均符合妊娠期高血壓的診斷標準。年齡20～39歲，平均年齡(25.38±2.86)歲；孕周22～37歲，平均孕周(35.68±2.31)周；孕次0～3次，平均孕次(2.35±0.65)次；體重50～73 kg,平均(56.68±3.46)kg；其中經產婦16例，初產婦60例，根據疾病的嚴重程度分為：輕度41例，中度22例，重度13例。選擇同期行健康體檢者孕婦45例，為正常妊娠組，年齡20～39歲，平均年齡(26.14±1.68)歲；孕周22～37周，平均(35.09±1.68)周，孕次0～3次，平均孕次(2.19±0.62)次；體重51～75 kg,平均(56.97±2.37)kg；其中經產婦10例，初產婦35例。選擇同期在體檢中心健康體檢者30例，為健康對照組，年齡24～42歲，平均年齡(26.38±2.18)歲；體重54～73 kg，平均(56.86±3.76)kg。3組年齡和體重等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：所有患者知情同意，均簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會通過。

1.2.2 排除標準：原發性高血壓；妊娠合并感染性疾??；胎兒異常；合并心、肝、腎和肺等重要障礙功能不全；代謝性，免疫性和腫瘤性疾??；有出血和血栓性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血液標本采集：患者入院后清晨空腹肘靜脈血約10 ml，4℃的條件下放置30 min，低速離心20 min，離心速度1 800 r/min，離心半徑15 cm，離心后去上清液，將其保存在-70℃冰箱中保存。

1.3.2 miRNA提取和逆轉錄反應：根據miRNeasy提取試劑盒的說明書提取miRNA，并通過紫外分光度將吸光度的比值在1.8～2.0的標本保存用于后續檢測，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反轉錄試劑盒的使用說明書將miRNA反轉錄為cDNA，標本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR檢測：根據GenBank中的miR-146a、miR-25和U6的序列號，并用Premier Primer 5.0軟件進行引物設計，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-146a引物序列，上游：CACGGACCTGAAGAACACTGG，下游：AGAAATGAAATTAGAACACACATCAATTCC，miR-25的引物序列，上游：CGGCGGCATTGCACTTGGTCTC和U6引物序列，上游：ATCCGCAAAGACCTGT，下游：GGGTGTAACACTXAAG。qRT-PCR的總反應體系為25 L，包括上下游引物各1.0 L(其濃度為10 mmol/L)，cDNA為0.8 L，RNaseH2O為12.2 L和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反應條件為：預變性溫度95℃10 min，95℃和60℃分別為5 s和60 s，總共進行40個循環。在60℃下用ABI7700軟件收集熒光信號進行溶解曲線分析，每個樣品進行3個平行復孔，相對表達量采用表示2-ΔΔCt，公式表達為ΔΔCt=試驗組(Ct目標基因-CtU6)-對照組(Ct目標基因-CtU6)。

1.3.4 血清CysC水平檢測：采用酶聯免疫反應方法對血清CysC水平進行檢測，采用武漢明德生物科技股份有限公司生產的試劑盒，按照使用說明書進行檢測，具體步驟：取血清100 μl加入到不同濃度的標準品分別放入反應孔中，用膠紙密封后，在37℃的條件下進行溫浴，90 min后，用洗滌液洗滌3次，每次5 min。用濾紙干燥反應板。除空白對照組外，其他均加入生物素抗體混合，溫度37℃，反應30 min。然后用洗滌液清洗反應板3次，每次5 min，避光孵育20 min，每孔加入終止液100 μl終止反應。使用酶標儀在450 nm處測定，根據測定值計算出血清樣本的實際含量，每個樣本測定3次，平均量為相對含量。

1.4 觀察指標 比較3組血清miR-146a、miR-25表達和CysC水平，觀察妊娠高血壓疾病患者血清miR-146a、miR-25表達和CysC水平與疾病嚴重程度和腎功能損害的關系及聯合檢測在腎功能損害方面的效能。

2 結果

2.1 3組血清miR-146a、miR-25表達和CysC水平變化 妊娠期高血壓疾病組患者血清miR-146a和CysC水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，正常妊娠組又高于健康對照組(P<0.01)；而妊娠期高血壓疾病患者血清miR-25表達水平明顯低于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，而正常妊娠組明顯低于健康對照組(P<0.01)。見表1。

組別miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)健康對照組(n=30)1.20±0.081.97±0.680.68±0.13正常妊娠組(n=45)1.47±0.12*1.49±0.43*0.87±0.18*妊娠期高血壓疾病組(n=76)2.38±0.28*#1.06±0.24*#1.38±0.39*# F值496.94661.28084.451 P值0.0000.0000.000

注：與健康對照組比較，*P<0.01；與正常妊娠組比較，#P<0.01

2.2 血清miR-146a、miR-25表達和CysC水平與妊娠期高血壓疾病嚴重程度的關系 隨著妊娠期高血壓疾病嚴重程度的增加血清miR-146a表達和CysC水平而出現明顯升高(P<0.01)，而miR-25表達出現明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

類別miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)輕度(n=41)1.86±0.241.26±0.18 0.92±0.21 中度(n=22)2.41±0.22* 0.95±0.21* 1.46±0.28*重度(n=13)3.97±0.27*#0.62±0.12 *#2.70±0.35*#F值471.35383.379284.769P值0.0000.0000.000

注：與輕度比較，*P<0.01；與中度比較，#P<0.01

2.3 血清miR-146a、miR-25表達和CysC水平與妊娠高血壓疾病出現腎損傷的關系 妊娠期高血壓疾病患者腎功能異常組的血清miR-146a表達和CysC水平明顯高于腎功能正常組(P<0.01)，而血清miR-25表達腎功能異常組明顯低于腎功能正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

組別miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)腎功能正常組(n=37)2.20±0.201.22±0.201.13±0.25腎功能異常組(n=39)2.55±0.260.90±0.151.62±0.34t值6.5527.9187.126P值0.0000.0000.000

2.4 妊娠期高血壓基本患者血清miR-146a、miR-25表達和CysC水平相關性 妊娠高血壓患者血清miR-25表達與miR-146a表達(r=-0.768，P<0.01)和CysC水平呈負相關(r=-0.812，P<0.01)，而miR-146a表達與CysC水平呈正相關(r=0.843，P<0.01)。

2.5 聯合血清miR-146a，miR-25和CysC水平妊娠期高血壓疾病腎功能損害的診斷效能 妊娠期高血壓疾病患者血清miR-146a和miR-25表達及CysC水平在檢測腎功能損害方面具有較高的靈敏度和特異性，將3個指標是否有腎功能損害在通過二元回歸分析，聯合指標(miR-146a+miR-25+CysC)具有明顯的線性關系，得回歸方程8.835 XmiR-146a-15.360miR-25+16.357CyC-13.372，并發現聯合檢測的曲線下面積為0.971，靈敏度為92.3%，特異度97.3%，在診斷腎功能損害方面明顯優于單獨miR-146a(Z=2.342，P=0.019)，miR-25(Z=2.210，P=0.034)和CysC(Z=2.919，P=0.004)，而3個指標之間的曲線下面積差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖1。

表4 聯合血清miR-146a、miR-25和CyC水平妊娠期高血壓疾病腎功能損害的診斷效能

圖1 聯合血清miR-146a、miR-25和CysC水平妊娠期高血壓疾病腎功能損害的曲線下面積

3 討論

妊娠期高血壓疾病主要以高血壓和蛋白尿為臨床表現，其發病機制仍不清楚，高血壓最早易受攻擊的靶器官是腎臟，現有研究認為妊娠期高血壓時，全身血管廣泛痙攣，導致血流動力學發生改變，出現內皮細胞受到損傷，腎血管痙攣，腎臟血流量明顯降低，腎小球濾過率明顯降低，出現血清肌酐升高，出現腎功能受到損害[9]。臨床上診斷腎功能損傷的指標是血清肌酐，但其濃度受到多種因素的影響，對腎小球的損傷并不特別敏感，尤其輕度受到損傷，血清肌酐仍在正常范圍。本研究發現妊娠期高血壓疾病患者血清CysC水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組，并且隨著妊娠期高血壓疾病嚴重程度升高而升高，說明CysC與妊娠期高血壓疾病的發生發展具有一定的關系，同時本研究還顯示CysC水平在腎功能異常組明顯腎功能正常組，并其通過受試者曲線分析發現當血清濃度>1.29 mg/L，其靈敏度為87.2%，特異性為81.1%，說明CysC能夠明顯反映妊娠期高血壓患者腎功能的損害程度，與文獻報道[9，10]一致。CysC是一種堿性的小分子蛋白質，共120個氨基酸，在體內濃度十分穩定，不受飲食，機體炎性和腫瘤等其他因素的影響[11]。而腎臟是清除CysC的唯一器官，并且其濃度與腎小球濾過率密切相關，與腎臟損傷程度呈正相關，現已經運用監測早期腎功能損傷，有助于早期做出干預措施，防止并發癥的發生。

本研究發現，妊娠期高血壓疾病患者血清miR-146a表達水平明顯高于正常妊娠組，并且隨著疾病嚴重程度的增加而增加，說明基因miR-146a參與了妊娠期高血壓疾病的發病過程。同時本組研究發現腎功能損害患者血清miR-146a水平明顯高于腎功能正?；颊?，說明miR-146a參與了腎臟損傷的過程，本組研究發現當血清相對表達量2.32時，在診斷腎功能損害方面具有較高靈敏度和特異性。miR-146a定位人類染色體5q34位點上，是一種多靶向基因調節器[12]?，F有研究證實其參與了動脈粥樣硬化疾病的發生發展過程，是急性冠脈綜合征的重要危險因素，是評價動脈粥樣硬化程度的重要指標，是急性冠脈綜合征病情評估的指標[13，14]。有研究顯示miR-146a參與了糖尿病腎病的發生發展過程，與參與了炎性反應和腎臟氧化應激損傷，是反映腎臟功能損害的有用指標[15]。

本研究還發現妊娠期高血壓患者血清miR-25表達水平明顯低于正常妊娠組和健康對照組，并且與妊娠期高血壓疾病嚴重程度呈負相關，說明miR-25是妊娠高血壓疾病的保護因子，參與了疾病的發生發展過程。本研究還發現腎功能異常的妊娠期高血壓疾病患者血清miR-25表達水平明顯低于腎功能正常組，在預測腎功能異常方面具有較高的特異性和靈敏度?，F已知miR-25是屬于miR-106 b-25家族，定位于7 q22.1染色體上，維持蛋白7基因內含子上。有研究證實miR-25在腫瘤組織中具有明顯表達，并在不同的腫瘤具有不同的功能[16]，而糖尿病合并腎臟損傷方面的研究發現miR-25主要通過對絲裂原活化蛋白激酶激酶4進行調控，從而達到對糖尿病腎病纖維化具有明顯的抑制作用[17]，而在妊娠期高血壓合并腎臟損傷方面未見報道。本研究發現miR-25表達與miR-146a表達和CysC水平呈負相關，而miR-146a表達與CysC水平呈正相關，說明miR-25和miR-146a與CysC具有一定的聯系，而miR-25與miR-146a呈負相關，可能內在存在某種平衡其具體引起妊娠高血壓腎臟損傷的機制需要進一步研究。本研究發現通過3個指標是否有腎功能損害在通過二元回歸分析，發現聯合指標具有明顯的線性關系，并發現聯合檢測的曲線下面積為0.971，靈敏度為92.3%，特異度為97.3%，在診斷腎功能損害方面明顯優于單獨miR-146a、miR-25和CysC，而3個指標之間的曲線下面積差異無統計學意義(P>0.05)，說明3個指標在檢測妊娠期高血壓腎病方面具有一定的特異性和靈敏度，聯合檢測能夠進一步提高其靈敏度和特異性，并且其曲線下的面積進一步提高，當妊娠高血壓患者血清相對表達量miR-146a>2.32和CysC>1.29 mg/L而miR-25≤1.02時，患者在診斷妊娠高血壓合并腎功能損害具有較高的特異性和靈敏度，對這些患者早期采取干預措施，進而降低妊娠高血壓疾病患者的不良預后。

綜上所述，miR-146a和miR-25參與了妊娠期高血壓疾病的發生發展，聯合檢測miR-146a、miR-25和CysC水平在預測妊娠期高血壓疾病患者腎功能損害具有重要的臨床價值。