支原體肺炎患兒肺泡灌洗液MP-DNA載量、免疫炎性指標與治療效果的關系研究

龐衛花 劉永濤 曹智麗 李金巍 陳珊 林曉燕 楊敬芳

肺炎支原體肺炎(MPP)是好發于兒童和青少年的常見呼吸系統疾病，由MP感染所致。其中難治性MPP患兒病情危重，治療難度大，不僅造成肺部炎性，嚴重者還引起心臟、腎臟、血液等多器官、多系統損害，對患兒生命安全造成極大危害[1]。目前，MPP發病機制仍未闡明，研究認為免疫炎性損害是該病發生發展的關鍵環節[2,3]。有文獻報道，MPP患兒肺泡灌洗液(BALF)中高菌量可誘導細胞因子異常表達，導致免疫功能紊亂[4]。本研究觀察MPP患兒肺泡灌洗液(BALF)中MP-DNA載量、細胞因子、T淋巴細胞亞群及免疫球蛋白變化，分析其與病情嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年10月至2016年6月我院診治的MPP患兒75例，分為輕癥MPP組(n=35)和重癥MPP組(n=40)。輕癥MPP組：男21例，女14例；年齡2～14歲，平均年齡(8.41±1.09)歲。重癥MPP組：男25例，女15例；年齡2～13歲，平均年齡(8.45±1.13)歲。另選取30例健康體檢兒童為對照組，男16例，女14例；年齡2～14歲，平均年齡(8.12±1.10)歲。3組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①符合小兒支原體肺炎診斷標準[5]：患兒主要表現為發熱、咳嗽等癥狀，胸片檢查顯示肺部大片陰影，肺紋理增粗；②血清IgM抗體呈陽性；③年齡1～14歲；④就診前2個月內未接受過相關治療；⑤患兒家屬知情同意。

1.2.2 排除標準：①伴有哮喘、肺結核等其他呼吸系統疾病者；②合并重要臟器功能不全者；③血液系統、免疫系統疾病患兒；④對本研究使用藥物過敏者。

1.3 治療方法 患兒給予降溫、止咳、平喘等對癥處理。常規治療基礎上給予阿奇霉素和布地奈德懸液治療。阿奇霉素10.0 mg/kg+250 ml 5%葡萄糖注射液，靜脈滴注，1次/d，連用3 d后停藥4 d，改為口服給藥，10.0 mg/kg，1次/d。布地奈德懸液2 ml/次+5 ml 0.9%氯化鈉溶液，霧化吸入，2次/d。療程2周。

1.4 觀察指標

1.4.1 BALF收集:患兒麻醉后將纖維支氣管鏡送達支氣管各段開口處，用37℃ 0.9%氯化鈉溶液對右肺中葉支氣管肺泡進行灌洗，劑量為0.5～1 ml/kg，灌洗3次后回收灌洗液，置于無菌容器中送檢。

1.4.2 MP-DNA載量:采用ABI 7500 熒光定量PCR儀測定MP-DNA載量，參照試劑盒說明書操作。MP-DNA>400 copies/ml即可判定為陽性。

1.4.3 細胞分類:收集BALF中細胞，瑞氏染色后于油鏡下計數200個細胞并分類。

1.4.4 細胞因子:采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3含量。

1.4.5 T淋巴細胞亞群:采用流式細胞術測定BALF中CD3+、CD4+、CD8+，計算CD4+/CD8+。

1.4.6 免疫球蛋白:采用免疫散射比濁法測定BALF中IgA、IgG、IgM。

2 結果

2.1 3組BALF中MP-DNA載量、MP-DNA陽性率、細胞含量比較 不同程度MPP患兒BALF中MP-DNA載量、MP-DNA陽性率、中性粒細胞百分比均明顯高于對照組，巨噬細胞百分比均明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組BALF中MP-DNA載量、MP-DNA陽性率、細胞含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

2.2 3組BALF中細胞因子、共刺激分子比較 不同程度MPP患兒BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別 IL-4IL-17IL-18IFN-αsB7-H3對照組(n=30) 16.79±2.528.56±1.1327.82±4.0712.51±1.3836.25±4.98輕癥MPP組(n=35)57.34±18.98*44.23±15.79*69.41±18.13*44.05±12.27*71.76±20.53*重癥MPP組(n=40)92.11±27.08*#83.64±26.36*#115.32±22.76*#69.42±18.45*#124.51±26.65*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

2.3 3組BALF中T淋巴細胞亞群比較 不同程度MPP患兒BALF中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對照組，CD8+均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 3組BALF中免疫球蛋白比較 不同程度MPP患兒BALF中IgA、IgG、IgM均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.5 MPP組治療前后BALF中MP-DNA載量、MP-DNA陽性率、細胞含量比較 MPP組患者治療后不同程度MPP患兒BALF中MP-DNA載量、MP-DNA陽性率、中性粒細胞組百分比均明顯低于治療前(P<0.05)，MPP組患者巨噬細胞百分比均明顯高于治療前，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

組別 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+對照組(n=30) 43.20±6.0934.89±5.0417.24±3.121.67±0.23輕癥MPP組(n=35)34.86±5.24*25.65±4.23*26.41±4.00*1.12±0.15*重癥MPP組(n=40)27.14±4.12*#18.99±3.12*#32.17±4.13*#0.78±0.10*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

組別IgAIgGIgM對照組(n=30) 1.60±0.2212.31±1.451.62±0.23輕癥MPP組(n=35)1.21±0.14*8.45±1.12*1.29±0.17*重癥MPP組(n=40)0.83±0.13*#5.89±0.78*#1.00±0.13*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

組別MP-DNA載量(log,MP-DNA copy/ml)中性粒細胞(%)巨噬細胞(%)MP-DNA陽性率[例(%)]輕癥MPP組(n=35) 治療前4.96±0.7214.06±2.1174.98±8.5523(65.71) 治療后3.49±0.58*8.21±1.23*80.33±9.15*15(42.86)*重癥MPP組(n=40) 治療前6.79±0.8321.22±3.3468.23±7.3937(92.50) 治療后5.00±0.93*#14.98±2.25*#73.79±8.46*#25(62.50)*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

2.6 MPP組治療前后BALF中細胞因子、共刺激分子比較 治療后不同程度MPP患兒BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3均明顯低于治療前(P<0.05)。見表6。

組別IL-4IL-17IL-18IFN-αsB7-H3輕癥MPP組(n=35) 治療前57.34±18.9844.23±15.7969.41±18.1344.05±12.2771.76±20.53 治療后46.23±12.43*32.56±10.52*48.98±13.26*32.67±9.13*58.45±15.21*重癥MPP組(n=40) 治療前92.11±27.0883.64±26.36115.32±22.7669.42±18.45124.51±26.65 治療后65.47±22.56*#59.61±21.06*#70.23±16.12*#48.00±12.56*#79.24±20.73*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

2.7 MPP組治療前后BALF中T淋巴細胞亞群比較 治療后不同程度MPP患兒BALF中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明顯高于治療前，CD8+均明顯低于治療前(P<0.05)。見表7。

組別CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+輕癥MPP組(n=35) 治療前34.86±5.2425.65±4.2326.41±4.001.12±0.15 治療后39.00±6.22*30.79±5.50*21.06±3.78*1.38±0.18*重癥MPP組(n=40) 治療前27.14±4.1218.99±3.1232.17±4.130.78±0.10 治療后32.31±5.06*#24.90±5.12*#27.23±5.22*#0.99±0.16*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

2.8 MPP組治療前后BALF中免疫球蛋白比較 治療后不同程度MPP患兒BALF中IgA、IgG、IgM均明顯高于治療前(P<0.05)。見表8。

組別IgAIgGIgM輕癥MPP組(n=35) 治療前1.21±0.148.45±1.121.29±0.17 治療后1.40±0.23*11.76±1.56*1.48±0.20*重癥MPP組(n=40) 治療前0.83±0.135.89±0.781.00±0.13 治療后1.13±0.19*#8.09±1.12*#1.22±0.19*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與輕癥MPP組比較，#P<0.05

3 討論

MP是引起呼吸系統感染性疾病的重要致病菌。MP感染不僅引起高熱、劇烈咳嗽、呼吸困難等肺部表現，也容易引起多種肺外并發癥，嚴重者出現多器官功能衰竭，病死率高[6,7]。近年來，難治性RMPP發病率逐年升高，且呈低齡化趨勢，該病治療周期長、治療效果差、并發癥多，患兒生命健康受到極大威脅，已經成為臨床工作的重點和難點。

文獻報道，MPP患兒BALF中MP載量與疾病臨床特征具有相關性，高MP載量患兒較低MP載量患兒病情嚴重，因而降低MP載量是提高臨床療效，延緩疾病進展為RMPP的關鍵環節[8]。此外，MP感染時機體主要利用巨噬細胞的吞噬作用清除病原體，這會造成巨噬細胞含量減低，同時肺泡腔中性粒細胞浸潤明顯，并與肺損傷嚴重程度呈正相關[9]。本研究結果顯示，不同程度MPP患兒BALF中MP-DNA載量、MP-DNA陽性率、中性粒細胞百分比均明顯高于對照組，巨噬細胞百分比均明顯低于對照組(P<0.05)，且治療后以上指標均明顯改善，提示MPP病情嚴重程度與MP-DNA載量及免疫細胞數量有關，重癥MPP患兒體內致病菌難以清除，從而誘發強烈的免疫炎性反應。

MP感染后能夠與宿主細胞膜表面受體結合直接造成細胞損傷，同時MP可刺激中性粒細胞、淋巴細胞等免疫細胞分泌IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α等細胞因子以抵御病原菌侵襲，同時進一步引起中性粒細胞、淋巴細胞的廣泛浸潤[10]。sB7-H3是共刺激分子B7家族成員，在健康人血清含量極低，而在MPP患兒血清sB7-H3水平增高，通過調節細胞免疫應答在疾病發生發展中發揮重要作用[11]。本研究結果顯示，不同程度MPP患兒BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3均明顯高于對照組(P<0.05)，且治療后以上指標均明顯改善，提示過度炎性反應及細胞因子的大量釋放是導致MPP患兒預后不良的重要原因，經積極干預后MP和炎性反應被顯著抑制。

研究顯示，MPP感染可誘發機體免疫功能紊亂，其中細胞免疫和體液免疫均參與MPP發生發展[12]。T淋巴細胞是機體介導細胞免疫應答的主要細胞，其中CD3+水平能夠反映T淋巴細胞活化程度，CD4+為輔助性T淋巴細胞，具有抵御、吞噬致病菌等作用，CD8+為抑制性T淋巴細胞，可有效抑制免疫應答并發揮細胞毒作用。另外，MP可直接刺激B淋巴細胞產生IgA、IgG、IgM，通過介導體液免疫應答在抵御病原體侵襲過程中發揮重要作用。其中IgA是機體清除、殺滅細菌、病毒、支原體的主要免疫球蛋白；IgM主要參與早期免疫應答過程，并可作為MPP診斷的血清學指標，檢測其水平能夠反映疾病嚴重程度；IgG是機體含量最多免疫球蛋白，在免疫應答晚期其水平升高，主要發揮中和游離外毒素等作用[13]。既往研究表明，MPP患兒外周血細胞免疫和體液功能紊亂，與疾病嚴重程度密切相關[14]。本研究結果顯示，不同程度MPP患兒BALF中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgA、IgG、IgM均明顯低于對照組，CD8+均明顯高于對照組(P<0.05)，且治療后以上指標均明顯改善，提示MP感染可能誘導機體免疫失衡，T淋巴細胞亞群和免疫球蛋白變化可做為評估MPP病情的指標，經積極干預后患兒免疫抑制狀態能夠顯著緩解。

綜上所述，MPP患兒BALF中MP-DNA載量、免疫炎性指標表達異常，且與病情嚴重程度密切相關，可作為判斷疾病治療效果及預后的參考依據。