NH4-N氮源下海洋酸化對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響?

賀云鳳， 逄 凱， 李克強， 梁生康， 王修林

(中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

氮是海洋生物生長和繁殖的重要元素之一，且已成為海洋生物生長和生物群落演替的限制因素, 此外，溶解無機氮(DIN)是浮游植物生長的必需營養物質[5-7]。NH4-N作為一種還原態氮形式，可被浮游植物直接吸收利用而不需消耗較多能量，而其它兩種DIN—NO3-N和NO2-N，則需要被硝酸還原酶(NR)還原成氨氮等還原態氮才能被浮游植物利用，所以在三種DIN中，浮游植物優先吸收利用NH4-N[8-9]。

在過去的幾十年里，有害藻華(HABs)對世界沿海地區的海洋漁業、公共衛生和水生環境造成巨大損害[10-12]，已經成為全世界沿海地區的主要環境問題之一[13]。東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)和米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)是中國東南沿海地區HABs的主要優勢藻種且二者存在演替現象[14-15]。近年來，東海原甲藻是中國東海海域大規模HABs的主要種類，常見于浙江沿岸和長江口的表層和次表層水域[16-19]。米氏凱倫藻是一種在全球廣泛分布的甲藻，它常在太平洋沿岸[20-25]、大西洋[26-28]和印度洋[29]以及中國東海發生形成HABs。米氏凱倫藻是一種典型的魚類毒性物種，其毒性對野生魚和養殖魚都是致命的[30-31]，除此之外，它還與貝類和其它無脊椎動物的死亡有關[32-36]。

浮游植物是主要的初級生產者，并在全球范圍內影響海洋的碳循環。不同浮游植物的CO2濃縮效率和調節機制不同，則其對海洋酸化的響應就不同。研究表明，海洋酸化對海洋原甲藻(Prorocentrummicans)、亞歷山大藻(Alexandriumsp.)和短孢角毛藻(Chaetocerosbrevis)的生長并無明顯影響[37-39]，而三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)的生長卻受到了海洋酸化的抑制[40-42]。

為此，本文選取東海原甲藻和米氏凱倫藻，在室溫、模擬光照條件下，以NH4-N為氮源, 通過增加pCO2改變海水的酸化程度，研究海洋酸化對米氏凱倫藻和東海原甲藻生長的影響，并分析兩種甲藻對NH4-N的吸收動力學和生物酶活性，探討其環境適應性。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種的培養

為了模擬海洋酸化對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的影響，培養實驗設置3個pH梯度：8.10(當前海水pH值)、7.81(21世紀末海水pH值)和7.45(高酸化海水pH值)，分別對應通入CO2濃度為380、800和1 500 μatm的混合空氣。培養實驗中使用的CO2混合空氣采用稱量法配置，即將純原料氣定量地從原料氣瓶轉移到混合氣氣瓶來制備，組分氣體的添加量通過稱量充裝前后的標準氣瓶來確定。同時，每個pH值設置兩個平行樣。

培養實驗所用東海原甲藻接種于中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室藻種室，米氏凱倫藻接種于中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室藻種室，將藻種均保存于f/2培養液并置于光照培養箱中(光照強度191 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h∶12 h，溫度為(20±1)℃)。將培養實驗所用海水(膠州灣近海海域，36°5′42″N, 120°15′41″E, PO4-P:0.946 μmol·L-1；NO2-N:0.561 μmol·L-1；NO3-N:0.842 μmol·L-1；NH4-N:1.453 μmol·L-1)經孔徑0.45 μm的醋酸纖維膜過濾以除去顆粒物，再將過濾海水置于高壓滅菌鍋中120 ℃下高溫高壓滅菌20 min。實驗采用5 L錐形瓶進行培養，向培養瓶中加入3.5 L滅菌海水，以錫紙(實驗前450 ℃下灼燒4 h)為蓋，分別通入不同CO2濃度的混合空氣，待三個pH梯度的海水碳酸鹽系統平衡后添加藻種，取100 mL東海原甲藻藻液和200 mL米氏凱倫藻藻液加入到3.5 L滅菌海水中，使藻密度達到2 000 cell/mL左右，再加入NH4-N(30 μmol·L-1，NH4Cl；國藥集團化學試劑有限公司(SCRC))和PO4-P(1.5 μmol·L-1，KH2PO4；國藥集團化學試劑有限公司(SCRC))，微量元素和維生素濃度按照f/2培養液濃度比例添加(上海光語生物科技有限公司)(見表1)。東海原甲藻培養實驗周期為10天，米氏凱倫藻培養實驗周期為20天，取樣頻次為1～2次/d，具體取樣頻次根據兩種藻的生長規律而定。取樣前將培養體系搖勻，取200 mL藻液經0.7 μm的 GF/F玻璃纖維膜(Whatman 公司，450 ℃下灼燒4 h)過濾，濾膜用于測定SOD酶、CAT酶活性和葉綠素，將濾液裝入60 mL的棕色玻璃瓶中，用于測定水體中的NH4-N，并將樣品置于-20 ℃下保存。

表1 東海原甲藻和米氏凱倫藻培養實驗條件Table 1 Experimental conditions of Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi

1.2 pH的調節與測定

為維持培養體系pH環境的穩定，在體系中加入生物緩沖劑HEPES[43-44](～0.04或～0.05 g·L-1)，并采用以間甲酚紫為指示劑的分光光度法測定體系的pH值[45]。為觀測pH的變化幅度，前期取樣較密集，觀測結果發現pH的波動范圍不大，即在培養后期減少了對pH的觀測次數。測得培養體系的pH值在整個生長周期內變化范圍為：0.1±0.05(見圖1)。

圖1 東海原甲藻和米氏凱倫藻培養期的pH波動Fig. 1 pH fluctuations in the culture seawater of Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi under experimental processes

1.3 分析方法

葉綠素a的測定[46]：濾膜經8 mL 90%的丙酮溶液在4 °C下避光提取24 h,離心10 min后取其上清液，以90%的丙酮溶液作為空白，采用紫外分光光度計測定630、647、664 nm波長下的吸光度。

SOD酶的測定[48]：依據SOD酶在光下對抑制氮藍四唑(NBT)的還原作用來確定SOD酶的活性，測定560 nm下的吸光度。

CAT酶的測定[48]：依據CAT酶可在磷酸緩沖液中催化H2O2，在240 nm波長下，可用H2O2的減少速率來確定CAT的活性。即以A240nm每分鐘減少0.01為1個CAT酶活性單位(U·mg-1·min-1)。

1.4 數據處理

采用Slogistic2生長模型計算東海原甲藻和米氏凱倫藻的終止生物量和最大生長速率，通過Origin8.5軟件(The Microcal Inc.)擬合生長曲線，公式如下[49]：

其中：Bt為t時刻的生物量(chla，μg·L-1)；Bf為終止生物量(chla，μg·L-1)；B0為初始生物量(chla，μg·L-1)；μmax為最大生長速率(μg·L-1·h-1)。

氮攝取通常用Michaelis-Menten方程計算，而為了覆蓋攝取和生長情況，本文采用Monod方程[50]并將其修改為：

本文通過SPSS 22.0軟件(SPSS Inc)對結果進行T檢驗來判斷數據是否存在顯著性差異，并設置顯著性差異水平為α=0.05。

2 結果

2.1 生長狀況

圖2為東海原甲藻和米氏凱倫藻在NH4-N和不同pH條件下的生長曲線。東海原甲藻和米氏凱倫藻分別于第2天和第3天開始快速生長進入指數生長期，并分別于第5天和第7天進入穩定生長期，此期間，東海原甲藻和米氏凱倫藻的chla濃度達到峰值，在pH=8.10條件下出現最大值(15.64和46.77 μg·L-1)，其次是pH=7.81處(9.75和43.17 μg·L-1)，在pH=7.45處chla濃度有最小值(7.45和8.62 μg·L-1)。隨后，東海原甲藻和米氏凱倫藻分別于第8天和第11天開始死亡，進入死亡期。在高酸化條件(pH=7.45)下，米氏凱倫藻的生長受到極大限制。

圖2 不同pH條件下東海原甲藻(A)和米氏凱倫藻(B)的生長曲線Fig. 2 Growth curve of Prorocentrum donghaiense (A) and Karenia mikimotoi (B) under different pH conditions

Slogistic2生長模型擬合結果表明，在NH4-N條件下，東海原甲藻和米氏凱倫藻的終止生物量和最大生長速率均隨pH的下降而降低(見圖3)。具體表現為，在pH=8.10處，東海原甲藻和米氏凱倫藻的終止生物量分別為15.76和49.76 μg·L-1，最大生長速率分別為0.182和0.357 μg·L-1·h-1；在pH=7.81處，東海原甲藻和米氏凱倫藻的終止生物量分別為8.66和43.17 μg·L-1，最大生長速率分別為0.076和0.250 μg·L-1·h-1；pH值為7.45時，藻類生長受到極大的限制，東海原甲藻和米氏凱倫藻的終止生物量分別為7.67和7.56 μg·L-1，最大生長速率分別為0.067和0.093 μg·L-1·h-1(見表2)。與自然條件下(pH=8.10)相比，東海原甲藻在pH=7.81處的終止生物量和最大生長速率分別下降了45.0%和58.2%，在pH=7.45處下降了51.3%和63.2%；米氏凱倫藻在pH=7.81處的終止生物量和最大生長速率分別下降了13.2%和30.0%，在pH=7.45分別下降了84.8%和73.9%。顯著性分析表明，東海原甲藻在pH=7.81和pH=7.45處的終止生物量和最大生長速率顯著低于(p<0.05)pH=8.10處，米氏凱倫藻在pH=7.45處的終止生物量和最大生長速率均顯著低于(p=<0.05)pH=8.10處的兩個參數，且米氏凱倫藻的終止生物量和最大生長速率顯著高于(p<0.05)東海原甲藻。

圖3 不同pH條件下東海原甲藻和米氏凱倫藻的終止生物量(A)和最大生長速率(B)Fig. 3 Terminative biomass (A) and maximum growth rate (B) of Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi under different pH conditions

2.2 氮吸收動力學

圖4為東海原甲藻和米氏凱倫藻在不同pH條件下對NH4-N的吸收曲線，NH4-N分別在96和168 h內被快速吸收。Monod方程擬合結果表明，東海原甲藻和米氏凱倫藻的最大氮吸收速率隨pH的下降而降低，半飽和常數和最小濃度閾值隨pH的下降而升高。具體表現為，在pH=8.10處東海原甲藻和米氏凱倫藻的最大氮吸收速率有最大值(0.59和0.39 μmol·L-1·h-1)，其次為pH=7.81處(0.46和0.34 μmol·L-1·h-1)，在pH=7.45處東海原甲藻的最大氮吸收速率有最小值(0.38和0.24 μmol·L-1·h-1)(見圖5(A))。顯著性分析表明，東海原甲藻和米氏凱倫藻在酸化(pH=7.81和pH=7.45)條件下的最大氮吸收速率顯著低于(p<0.05)正常海水條件下，且東海原甲藻的最大氮吸收速率顯著高于(p<0.05)米氏凱倫藻。

在pH=7.45處東海原甲藻和米氏凱倫藻的半飽和常數有最大值(1.36和7.81 μmol·L-1)，其次為pH=7.81處(0.39和2.31 μmol·L-1)，在pH=8.10處有最小值(0.24和1.57 μmol·L-1)(見圖5(B))。顯著性分析表明，米氏凱倫藻在pH=7.81和pH=7.45處的半飽和常數顯著高于(p<0.05)pH=8.10處，且其在pH=7.45處的半飽和常數顯著高于(p<0.05)東海原甲藻。

在pH=8.10處東海原甲藻和米氏凱倫藻的最小濃度閾值有最小值(1.10和1.30μmol·L-1)，其次為pH=7.81處(2.10和2.17 μmol·L-1)，在pH=7.45處有最大值(2.10和7.37 μmol·L-1)(見圖5(C))。

表2 不同pH條件下東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長和氮吸收動力學參數Table 2 Growth and nitrogen uptake kinetics parameters for Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi under different pH conditions

圖4 不同pH條件下東海原甲藻(A)和米氏凱倫藻(B)的氮吸收曲線Fig. 4 Nitrogen uptake curve of Prorocentrum donghaiense (A) and Karenia mikimotoi (B) under different pH conditions

Vmax/Ks比率可代表所有養分吸收位點的總親和力之和，涉及單一藻類和不同條件下特定過程的比率，Vmax/Ks比率越高表明競爭能力越高，可用來表征藻類在競爭生長中的地位。隨著酸化程度加深，東海原甲藻和米氏凱倫藻的Vmax/Ks比率均呈現下降趨勢。在pH=8.10處東海原甲藻和米氏凱倫藻的Vmax/Ks比率有最大值(2.46和0.25 h-1)，其次為pH=7.81處(1.18和0.15 h-1)，在pH=7.45處東海原甲藻和米氏凱倫藻的Vmax/Ks比率有最小值(0.28和0.03 h-1)(見圖5(D))。與自然條件下(pH=8.10)相比，東海原甲藻在pH=7.81處的最大氮吸收速率和Vmax/Ks比率分別下降了22.0%和52.0%，在pH=7.45處下降了35.6%和88.6%；同樣，米氏凱倫藻在pH=7.81處的最大氮吸收速率和Vmax/Ks比率分別下降了12.8%和40.0%，在pH=7.45處分別下降了38.5%和84.0%。顯著性分析表明，東海原甲藻在pH=7.45處的Vmax/Ks比率顯著低于(p<0.05)pH=8.10處，且東海原甲藻在三個pH條件下的Vmax/Ks比率均顯著高于(p<0.05)米氏凱倫藻。

2.3 SOD和CAT酶活性

受酸化條件的影響，東海原甲藻和米氏凱倫藻的SOD和CAT最大酶活性均隨pH的下降而升高。東海原甲藻和米氏凱倫藻SOD的最大酶活性在pH=8.10處分別為1.40和2.51 U·μg-1，隨著pH值的降低，在pH=7.81處SOD的最大酶活性分別升高至2.12和4.90 U·μg-1，在pH=7.45處，東海原甲藻和米氏凱倫藻的SOD最大酶活性分別升高至2.26和5.76 U·μg-1(見圖6(A))。同樣，東海原甲藻和米氏凱倫藻的CAT最大酶活性在pH=7.45處最高(5.09和4.40 U·mg-1·min-1)，其次是pH=7.81處(4.29和3.63 U·mg-1·min-1)和pH=8.10處(4.06和3.61 U·mg-1·min-1)(見圖6(B))。顯著性分析表明，在pH=7.81和pH=7.45處，米氏凱倫藻SOD的最大酶活性顯著高于(p<0.05)pH=8.10處，且米氏凱倫藻SOD的最大酶活性顯著高于(p<0.05)東海原甲藻。

圖5 不同pH條件下東海原甲藻和米氏凱倫藻的最大氮吸收速率(A)、半飽和常數(B)、最小濃度閾值(C)和Vmax/Ks比率(D)Fig.5 Maximum nitrogen uptake rate (A), half-saturation constant (B), min-concentration threshold (C) and the Vmax/Ks ratio (D) of Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi under different pH conditions

圖6 不同pH條件下東海原甲藻和米氏凱倫藻的SOD(A)和CAT(B)最大酶活性Fig. 6 SOD (A) and CAT (B) maximum activity of Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi under different pH conditions

3 討論

海洋浮游植物是世界生態系統的基礎，它們對全球變化的響應將影響海洋食物網和全球養分的循環。這些單細胞初級生產者隨著潮汐和水流漂移，占據全球碳固定的一半左右，并成為將固定碳匯入到深海生物碳泵的基礎[51]。高強度的人為活動導致大氣CO2濃度升高，表層海水的pCO2上升、pH下降，從而影響了海洋初級生產者的生長[52-53]。甲藻作為一個世界性的浮游植物群體，具有大量繁殖形成有害藻華的能力，其細胞內的RubisCO酶對CO2的親和力較低，光合作用易受碳濃度的限制，因此甲藻的生長更易受酸化的影響[54]。在本研究中，東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長均受到酸化條件的抑制。隨著酸化程度的加深，東海原甲藻和米氏凱倫藻的最大生長速率和終止生物量均呈下降趨勢，這是因為酸化程度的加深導致浮游植物需消耗更多的能量以適應這種變化，從而減少了用于浮游植物生長的能量而受到負面影響。

在海洋系統中，氮元素通常是限制浮游植物生長的營養物質，人類活動導致的氮元素輸入的增加可以顯著改變許多陸地、海洋以及一些淡水環境中的藻類和微生物的生產[55]。受海洋酸化的影響，東海原甲藻和米氏凱倫藻的最大氮吸收速率和Vmax/Ks比率均隨pH值的降低而下降。米氏凱倫藻在同等條件下的最大氮吸收速率和Vmax/Ks比率均低于東海原甲藻，表現為較低的競爭能力,酸化過程加劇了這種影響。研究表明，當海水中存在多種形式的氮時，浮游植物將優先使用還原形式氮(NH4-N)，因為浮游植物可以通過GS / GAGOT酶直接吸收NH4-N而合成氨基酸[56]，且甲藻能夠在低NO3-N、高NH4-N的海域大量繁殖[57]。酸化條件會降低能量在細胞內的流通，進而降低細胞對氮的吸收，即在酸化條件下會降低細胞內蛋白質的合成效率[58]。維持細胞內外的離子濃度平衡對浮游植物的生長至關重要，酸化強度加深，細胞內外的pH平衡受到破壞，浮游植物需要消耗大量的能量去維持平衡，進而抑制了浮游植物的生長[59]。在本研究中，pH=7.81和pH=7.45的酸化條件打破了東海原甲藻和米氏凱倫藻正常的細胞內外離子濃度的動態平衡，兩種藻必須對酸化條件作出響應并建立適應pH值變化的酸堿平衡，從而影響了藻細胞內正常的代謝速率，所以兩種藻對NH4-N的吸收隨酸化程度的加深而減少。由Monod方程擬合得到的最小濃度閾值均隨pH的降低而增大，由此可見，酸化強度越大，米氏凱倫藻和東海原甲藻對氮的吸收利用率就越低。

在正常情況下，浮游植物體內存在一套完整的抗氧化系統，且ROS的產生和清除始終處于動態的平衡狀態[58]。當浮游植物處于海洋酸化條件下，低pH值會導致浮游植物細胞的內外酸堿失衡，進而可激活抗氧化系統，消除過量產生的氧自由基，從而維持正常的浮游植物生理活動[60-61]，SOD酶和CAT酶是這個過程中主要的抗氧化酶。研究發現東海原甲藻的生長在受亞麻酸脅迫時，藻細胞內的SOD和CAT活性隨著亞麻酸的濃度升高而升高[62]。同樣，受氧化作用的脅迫，米氏凱倫藻細胞內SOD和CAT的活性也隨之升高[63]。在本研究中，酸化條件下，海水pH值的變化打破了東海原甲藻和米氏凱倫藻細胞內外的酸堿平衡，導致細胞內SOD和CAT的酶活性升高，以此消除過量的ROS對藻細胞的影響，即通過自身的生理調控機制來維持浮游植物正常的代謝活動。當海水pH值低于一定閾值時，浮游植物體內的調控系統達到極限，會導致浮游植物細胞酸中毒進而影響其生長和對氮的吸收，比如在pH=7.45條件下，米氏凱倫藻的生長受到了極大限制。

4 結論

通過實驗室藻類培養實驗研究了海洋酸化對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長、氮吸收和生物酶的影響，實驗結論如下：

(1)海洋酸化對東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長均有抑制作用。隨著酸化程度的加深，兩種藻的終止生物量和最大生長速率均呈現下降的趨勢。在高酸化(pH=7.45)條件下，米氏凱倫藻的生長受到的抑制更大，顯著低于正常海水條件(P<0.05)。

(2)海洋酸化抑制了東海原甲藻和米氏凱倫藻對NH4-N的吸收。隨著酸化程度的加深，兩種藻的最大氮吸收速率和Vmax/Ks比率均呈現下降的趨勢。米氏凱倫藻在同等條件下的最大氮吸收速率和Vmax/Ks比率均低于東海原甲藻，表現為較低的競爭能力，酸化過程加劇了這種影響。

(3)海洋酸化誘導了米氏凱倫藻和東海原甲藻的ROS升高，隨著酸化程度加深，抗氧化生物酶(SOD和CAT)的活性升高。海洋酸化對兩種甲藻生長的影響，通過抗氧化酶的活性變化從生理層面對外界環境的變化作出響應，與生長和氮吸收過程相對應。