魚類抗菌肽的研究進展

胡媛媛，姚 波

重慶科技學院化學化工學院；工業發酵微生物重慶市重點實驗室（重慶科技學院），重慶 401331

近年來，由于醫藥、食品和農業等領域中抗生素的過度使用和誤用，致使細菌耐藥性和食品藥物殘留等問題日益突出。據統計，若2014 到2050年間不采取任何措施來解決抗生素濫用和細菌耐藥性發展的趨勢，估計有3 億人會因抗藥性而過早死亡，導致60～100 萬億美元的經濟損失［1］。由于耐藥病原體的數量逐漸增多，迫切需要新的抗菌藥代替現有抗生素?？咕模╝ntimicrobial peptides，AMPs）作為防御微生物的有效武器，因其廣譜的抗菌活性、獨特的作用機制和罕見的抗生素抗性變體（antibiotic-resistant variants）特性而備受關注（見圖1）。AMPs 是細菌、昆蟲、植物和脊椎動物等幾乎所有生物體先天免疫的一部分，除了抗炎和免疫調節特性外，對細菌、真菌、寄生蟲、原蟲和病毒等具有廣譜抗菌活性，且對癌細胞具有細胞毒性。近些年，AMPs 在治療皮膚感染、血管生成、炎癥反應、細胞信號轉導、創面愈合、局部和全身適應癥方面的研究取得了實質性進展［2-4］。

AMPs 最先發現于1939 年，研究人員從芽孢桿菌（Bacillus brevis）中提取了克拉霉素（短桿菌肽Gramcidin），然后在1981 年分離出天蠶素（Cecropin）和Magainin［2］。脊椎動物抗菌肽最早于20 世紀80 年代中期在兩棲動物、人和家兔中發現，魚類AMPs 雖在同一時期被發現，但卻直到1996 年才首次檢測到其具有抗菌活性［5］。

AMPs 通常被認為是先天免疫的重要組成部分，是抵御多種病原體的第一道防線。AMPs 的二級結構是它攻擊病原菌的關鍵因素，其二級結構可大致分為4 類，其中有α-螺旋，含2 個或多個二硫鍵的β-直鏈，存在單個二硫鍵和或肽鏈環化β-折疊，伸展的肽鏈。AMPs 都是陽離子型或兩親性的，大多數AMPs 都能破壞細菌細胞膜，使內容物泄漏，出現空泡化。AMPs 通過破壞細胞膜迅速殺死入侵的病原體，使病原體很難產生耐藥性。AMPs 能夠與細菌DNA、RNA 結合來抑制蛋白質合成，并導致細菌死亡。某些AMPs 可以通過抑制細胞的呼吸作用和與細菌的熱休克蛋白結合發揮抗菌活性［3］。

魚類經常受到各種病原體的挑戰，這些病原體不僅對魚類的健康有害，且增加了它們對傳統抗生素產生耐藥性的風險。由于魚類更依賴先天免疫，所以魚類AMPs 可以作為潛在的防御武器對抗新出現的毀滅性感染性疾?。?］。本文對魚類AMPs 的分類、結構特征、抗菌譜及作用機制、分子設計等研究進展進行綜述，以期為更好地將其用于漁業生產和防病治病，開發綠色環保養殖技術，促進養殖漁業健康可持續發展。

1 魚類AMPs 分類

AMPs 是一大類具有獨特結構的生物分子，通常含有12 到50 個氨基酸殘基，由于分子中包含2個或者更多的帶正電的氨基酸殘基，如精氨酸、賴氨酸，或者在酸性環境中的組氨酸，且疏水結構域一般超過50%，可以基于其氨基酸組成和結構進行分類［7］，根據已知魚類AMPs 的分類、結構特征、表達部位等信息見表1，按照不同類型AMPs 抗菌譜整理成表2。

1.1 Piscidin 類

Piscidin 含18～26 個氨基酸，呈α-螺旋，具有高度保守的氨基末端，富含組氨酸和苯丙氨酸。首次于雜交條紋鱸魚［hybrid striped bass（Morone saxatilis×M.chrysops）］的肥大細胞中分離得到，Piscidin 具抗真菌、抗寄生蟲和抗病毒活性［8-9］。此外，在同一物種中還發現了多種Piscidin 亞型，主要在鰓、皮膚和腸中表達，也在頭、腎和脾中表達［5，10］。

1.2 Defensin 類

Defensin 由18～45 個氨基酸組成，含6～8 個保守的半胱氨酸，對細菌、真菌和許多包膜病毒和非包膜病毒都有一定的抗菌活性，根據半胱氨酸形成二硫鍵的配對和定位不同將其分為α-，β-，θ-Defensin 3 類［11］。目前已發現該抗菌肽的4 個基因和5 個亞型，主要在頭、肝、眼、性腺、肌肉和皮膚等部位表達［5，12］。

圖1 抗菌肽作用機制模式圖［3］Fig.1 Action mechanism diagram of antimicrobial peptides［3］

1.3 Hepcidin 類

Hepcidin 的前肽含有85 個氨基酸殘基，由3 個部分組成：信號肽（24 個氨基酸）、前肽（40 個氨基酸）和成熟肽（21 個氨基酸），該基因有2 個內含子和3 個外顯子［13］，主要在肝臟中表達。Hepcidin 作用廣泛，對革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌均有活性，具有抗病毒、抗寄生蟲、免疫調節、抑制真菌和酵母生長等作用［13-14］。同時，Hepcidin 作為鐵調節激素，還控制巨噬細胞和肝細胞的鐵釋放，限制鐵釋放到血漿中的量［15］。

1.4 Cathelicidin 類

Cathelicidin 含12～80 個氨基酸不等，其中由23～37 個氨基酸組成的肽呈線性肽鏈，折疊形成兩親性的α-螺旋；12～18 個氨基酸的肽鏈形成具有二硫鍵的β-發夾結構；39～80 個氨基酸組成的肽鏈顯示重復的脯氨酸基序，形成擴展的多脯氨酸型結構［16］。Cathelicidin 對細菌、原生動物、真菌和病毒都有一定的抑制作用，在鰓、頭腎、腸道、皮膚和脾等部位表達［16-18］。

Cathelicidin 首次在脊椎動物中發現是從大西洋海鰻（Myxine glutinosa）的腸道中分離出了3 種有效抗菌肽（HFIAP-1，-2 和-3），然后在被細菌感染的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中也發現了Cathelicidin 的表達［18］。

1.5 Pardaxin 類

Pardaxin 含33 個氨基酸殘基，是從紅海比目魚（Pardachirus marmoratus）的毒液中分離出來的多肽神經毒素，具有螺旋-鉸鏈-螺旋結構?？赏ㄟ^裂解細菌壁來抑制細菌生長，此外，還能抑制腫瘤細胞系的增殖，誘導細胞凋亡［19-20］。

表1 已知來源于魚類的抗菌肽Tab.1 List of known antimicrobial peptides from fish

續表1

表2 抗菌肽的抗菌譜Tab.2 Antibacterial spectra of AMPs

2 影響AMPs 活性的因素

2.1 電 荷

AMPs 的陽離子性質使其能夠通過靜電吸引與微生物相結合，或者在吞噬細胞攝取微生物后增強其殺滅作用。當AMPs 在微生物表面積累達到臨界濃度時，其疏水面在微生物細胞質膜內滲透和組裝形成離子通道或水孔，導致微生物低滲透裂解死亡［36］。

Lee 等［37］測試AMPs 抗菌活性的實驗中，天蠶素樣肽C 端含有疏水性螺旋，對革蘭氏陰性菌有很高的抗菌活性。Papiliocin 對革蘭氏陰性菌的抗菌活性與天蠶素A 相似。然而，Papiliocin 在N-端螺旋中的凈電荷為+6，而天蠶素A 為+5。因此，作者推測Papiliocin 含陽離子度更高是Papiliocin 對革蘭氏陽性菌的抗菌活性高于天蠶素A 的潛在原因。魏曉曉等［38］設計將牛血紅蛋白源AMPs 的第1、2 位的Val和Asp 都替換為Arg 后合成多肽，發現合成肽的靜電荷比原AMPs 凈電荷數多2，其抑菌活性比原AMPs 的高，對紅細胞的滲透脆性影響很小，有較高的安全性。

2.2 疏水性

適當的疏水性可使肽對帶電膜和中性膜的親和力增加［39］。Chen 等［40］通過用疏水性較弱的丙氨酸取代亮氨基或用亮氨酸殘基取代丙氨酸殘基，系統性地降低或增加疏水性，發現處于疏水性臨界值時抗菌活性最強。在臨界值的一定范圍內增強疏水性可提高抗菌能力，但超過或者低于該范圍都會使抗菌活性顯著降低。郝剛［41］在BF2-A 第10 位精氨酸上接入序列RLLR 并用亮氨酸取代第8 位上的纈氨酸，設計合成了一個新肽BF2-X。與BF2-A 相比，BF2-X 的螺旋度與正電荷增加，疏水性比例提高，C-端兩親性增強。在抗菌活性測試中，BF2-X 對大腸桿菌和金葡菌的抗菌活性是BF2-A 的兩倍，且殺菌比BF2-A 更為快速。

2.3 二級結構

AMPs 具有豐富的二級結構，包括由2～3 個二硫鍵形成穩定的β-折疊、兩親性α-螺旋結構、環化肽和帶有1～2 個氨基酸殘基的延伸肽鏈，通過調整肽的結構可適當地提高抗菌活性［2］（見圖2）。Wang 等［42］為研究AMPs polybia-MPI 結構與活性的關系，設計并合成了由L-Pro 分別取代Leu7，Ala8和Asp9的三種類似物。Leu7和Asp9的L-Pro 取代物α-螺旋構象的含量降低，Ala8 的L-Pro 取代物徹底破壞了α-螺旋構象。L-Pro 取代物抗腫瘤活性顯著降低，表明polybia-MPI 的α-螺旋構象對抗腫瘤活性十分重要。

圖2 抗菌肽二級結構破壞細菌模式圖Fig.2 Schematic diagrams of disruption of secondary structure of AMPs to bacteria

2.4 二硫鍵

二硫鍵是比較穩定的共價鍵，其形成和還原是局部的、兩態的，在結構上有明顯變化。二硫化物是穩定的共價中間體，其結構可以表征和分離［43］。Bai 等［44］對防御素活性與結構研究中發現，天然二硫鍵在進化中是保守的，雖然對防御素抗菌作用影響不大，但是有助于肽結構穩定性和趨化活性。同時，在其他抗微生物肽中也有類似發現，如Tachyplesin 和polyphemusins 等。Lee 等［45］采用酶解和質譜分析相結合的方法確定了Coprisin的二硫鍵對，發現消除Coprisin 中任何一對二硫鍵，其抗菌活性都將消失，但抗真菌活性存在。通過圓二色譜（CD）分析表明，Coprisin 的2 個二硫鍵Cys20-Cys39 和Cys24-Cys41 穩定Coprisin 的α-螺旋區，從而影響其抗菌活性和穩定性。

3 AMPs 分子的定向改造

3.1 擴大抗菌譜

在擴大AMPs 抗菌譜的研究中，構建雜合AMPs 是目前應用比較廣泛的技術（見圖3）。Wang 等［46］利用基因拼接技術將Attacin 和Thanatin構建成雜合肽Attacin-Thanatin，插入質粒pET-32a（+）中，并在大腸桿菌Rosetta 中誘導表達。生物活性檢測表明，該肽能有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等的生長，且雜合肽對測試細菌的抗菌活性略高于單一的AttacinAMPs，對豬紅細胞幾乎沒有毒性。張宏剛等［47］采用重疊延伸技術合成抗菌肽Melitti 和Mytilin-B 的功能序列，得到雜合AMPs Mel-MytB（MEM）。對其表達產物進行測定，雜合肽具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有較強的抑菌活性，同時具有熱穩定性和酸穩定性的特點。

圖3 AMPs 雜合擴大抗菌譜模式圖Fig.3 Schematic diagrams of broadening of antimicrobial spectra of AMPs by hybrid

AMPs 數據庫篩選與計算機分子設計為擴大AMPs 的抗菌譜提供了新的思路。中東呼吸綜合征（MERS-CoV）在目前尚無有效的治療手段，Mustafa 等［48］通過對MERS-CoV 的刺突蛋白進行計算機對接研究，根據特定的理化性質從AMPs 數據庫（APD3）中檢索篩選出合適的AMPs；利用Piper 技術，通過蛋白質-肽對接過程中形成的簇數來測量肽的結合模式。從而得到可能與MERS-CoV 的刺突蛋白結合的AMPs 分子，這些AMPs 可能在發揮抑制作用方面至關重要。通過對208 個聚類大小的分析，得到7 個具有良好結合分數的假定肽。

3.2 提高穩定性

在分離、純化等過程中，分子量小且表達產物穩定性不高的AMPs 易受蛋白酶的影響而降解，多肽固有的代謝降解不穩定性是將肽類藥物推向市場的一大難題［49］。殘基取代這一改造方法可顯著地提高AMPs 的穩定性。在Adam 等［50］的研究中，EFK17 是取自LL-37 具有抑菌活性的肽段。在其蛋白酶切割位點用d-對映體或色氨酸取代，且在末端酰胺化和乙?；玫紼FK17 的變體。在酶反應條件下，LL-7 及EFK17 只有不到20%的肽段未被消化，而被d-對映體取代的EFK17 同源物未顯示任何明顯的蛋白水解跡象。截斷也是提高多肽水解穩定性的一種途徑。

3.3 提高抗菌活性

AMPs 的抗菌活性與其抑制或殺滅病原微生物的能力緊密相關，宋雪瑩等［51］截取Lactoferricin B AMPs 前15 個氨基酸，截取多肽與Lactoferricin B有相同的抗菌活性，經一系列設計連接，合成牛乳鐵蛋白素-天蠶素（Lactoferricin B-Cecropin）。抑菌活性試驗表明設計的雜合肽Lactoferricin B-Cecropin 具有更明顯的抗菌活性，且在抑菌濃度范圍內幾乎無溶血作用。Kim 等［52］合成的雜合AMPs HP-ma 的抑菌活性是HP 和Magainin 的2-32 倍，HP-MA 對囊泡裂解比HP 和Magainin 更有效。熒光各向異性法檢測結果表明HP-MA 比Magainin 具有更大的膜裂解活性。

AMPs 在細菌感染等潛在臨床治療中仍存在許多缺點，將其與商業抗生素結合使用或許是有效的解決途徑之一。Arenas 等［53］采用化學合成了4 種AMPs，分別為Pin2［G］、Pin2、P18K 和FA1。4種AMPs 對單一的微生物具有很好的抑制效果，肽FA1 對銅綠假單胞菌抑菌效力最大，Pin2［G］抗金黃色葡萄球菌活性最好。為得到抗菌效果最佳的AMPs，將AMPs 與8 種商用抗生素（阿莫西林、阿奇霉素、頭孢曲松、慶大霉素、左氧氟沙星、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶和萬古霉素）組合。根據分級抑菌濃度指數，FA1 與左氧氟沙星和磺胺甲惡唑的組合具有最佳的抗菌效果；FA1 或Pin2［G］與其他抗生素的組合表明，這些組合的總抑制作用大于AMPs或抗生素單獨作用的總和。

3.4 降低毒性

在開發AMPs 類藥物過程中，AMPs 具備天然的優良特性，但也存在一定的缺點，除了抗菌活性低外，部分AMPs 對細胞還有毒性的影響。Van Dijk 等［54］研究了Cathelicidin 類AMPs 鉸鏈區的氨基酸被取代后對細胞毒性的影響，發現雞紅細胞在含40 μmol/L 的CATH-2 條件下有26%的細胞被裂解。在相同濃度下，甘氨酸取代脯氨酸后的肽引起的溶血減少至10%，而被亮氨酸取代的肽沒有導致溶血現象。

Nagarajan 等［55］使用最大共同子圖法（maximum common subgraph approach）設計了AMPs，通過優化現有子圖形的疊加來生成新的圖形，以便在新設計中表示最多的數據庫子圖形。設計得到的最優肽為Ω76，重復使用亞致死劑量Ω76 處理的小鼠未顯示出慢性毒性的跡象；且在小鼠中對碳青霉烯（Carbapenem）和替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌（tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii）表現出較高效力；與亞致死粘菌素劑量同時使用的亞致死W76 劑量，無附加毒性。這些結果表明Ω76 具有潛在的補充或替代粘菌素的作用，特別是在腎毒性方面。

4 展 望

AMPs 是非常具有潛力的能代替抗生素的蛋白類物質，但在作為臨床藥物的開發過程中存在許多問題亟需解決，首先AMPs 類藥物產量低，生產成本高；其次是分子機制和作用機理尚不明確，限制了其作為藥物在臨床的安全使用；第三，兼具高抗菌活性、廣抗菌譜和低毒性等優點的新型AMPs 還有待進一步研究。未來在以下方面著力有望加速AMPs 在生產實踐中的應用。

4.1 開發表面固定化技術

研究表明［56］，固定化抗體技術通過以一種正確的空間取向將抗體固定到固相表面，在完全保留抗體構象和活性的同時最大化抗體的結合能力，展現出良好的應用前景。AMPs 具有廣譜活性、快速殺菌、生物相容性好和耐藥能力強等優點，是一種極具應用前景的固定化材料。開展AMPs 表面固定化技術研究，將其固定在生物膜表面，可以較傳統技術延長其作用時間和維持有效的作用濃度，也有利于可聚合陽離子（Abominable polycation）的生物相容性問題。同時，固定化肽可以以多種方式影響細菌細胞，從基因組重編程（genome reprogramming）到細菌死亡。提高對固定化AMPs 抗菌效果及作用機制的研究，對優化固定化AMP 具有指導意義，并為AMPs 抗耐藥性的發展提供新的思路。

4.2 研究AMPs 的緩控釋新劑型

緩釋制劑能在長時間內持續放藥達到長效作用，控釋制劑能在預定的時間內使藥物按照預定的速度釋放，血藥濃度可長時間維持在有效濃度范圍之內。目前，AMPs 類藥物存在用藥穩定性的問題，因而無法掌握藥物劑量的使用。將AMPs 藥物與緩控釋技術相結合，可使抗菌藥物持續釋放，以此調節宿主的免疫反應，并大大降低手術和受傷后獲得性感染的發生率。同時，這種方法可能潛在地減少對抗生素耐藥性的發展。近年來，使用納米包封技術治療性抗感染創面敷料的研究體系逐漸形成，研究人員基于誘導AMPs 基因表達和納米纖維包封技術的研究，提高了宿主免疫反應，可從許多方面攻擊病原體而不是像傳統抗生素那樣的單一，從而限制了抗性細菌的選擇。

但是迄今為止，很少有研究考察由納米材料形成的免疫調節化合物的包封性在誘導AMPs 生產中的作用。展望未來，需要多學科團隊利用體外和體內模型進行臨床前研究，研究多種免疫調節劑聯合應用于抗菌藥物生產，重要的是還需要進一步的研究來優化化合物的包封和釋放。

4.3 機器學習設計全新的AMPs 分子

隨著計算機和大數據科學的發展，以機器學習為代表的人工智能技術在分子設計和分子改造中的應用越來越廣泛，并日益突出其相對于傳統分子設計方法的準確高效的優勢。機器學習的核心在于系統計算法，用計算的方法來模擬人類的學習行為——從歷史經驗中獲取規律（或模型），并將其應用到新的類似場景中，其優點可以概括為大數據、大模型、大計算。在大數據方面，運用基因組、宏基因組、蛋白質組、代謝組學和抗菌譜研究數據，開展AMPs 基因、蛋白質分子與抗菌譜關聯分析，從海量數據中獲取候選分子關鍵信息；在大模型方面，基于細菌、病毒和腫瘤細胞生物膜的結構特征，建立膜-AMPs，AMPs-受體蛋白互作模型，開展分子動力學研究；在大計算方面，可以綜合考慮多物種的AMPs、受體分子和生理環境（pH 值、滲透壓、離子強度等）因素，模擬在體作用機制。

可以預見，隨著大規模分子篩選、人工智能及合成生物學等新技術的不斷進步，AMPs 應用于臨床，在更大范圍和更深廣度上代替抗生素的時間不會遙遠，人類也會得到更安全更環保的優質水產品。