利用單分子實時測序技術確定抗旱轉基因玉米染色體插入位置（2020.4.12 萊肯生物）

安全評價是轉基因作物商業化的必要條件，鑒定外源片段在基因組的插入位置其中重要的環節。熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）和染色體步移（Genome Walking）技術是檢測基因組側翼序列的常用方法，而第二代測序技術（NGS）的快速發展為此提供了低成本高通量的鑒定方案。然而，基于PCR的方法和NGS技術難以識別復雜基因組序列的所有轉基因事件插入位點、側翼序列以及外源片段插入后的修飾或重排。

中國農科院王天宇團隊利用農桿菌介導的方法將來源于高粱的外源基因SbSNAC1轉入玉米，獲得了耐旱轉基因玉米株系SbSNAC1-382。Southern雜交表明SbSNAC1-382是一個雙拷貝插入事件，兩個拷貝可能被插入到基因組的同一位置。在使用染色體步移法和全基因組測序法（WGS）檢測側翼序列失敗后，研究組采用單分子實時測序（single-molecule real-time，SMRT）技術成功鑒定出了外源片段的基因組側翼序列。研究人員首先構建了轉基因玉米基因組fosmid文庫，該文庫包含4.18×105個克隆，插入片段平均長度為35kb，覆蓋玉米基因組的5.85倍;然后，用特異性引物篩選出3個陽性克隆，并用單分子實時測序技術對其中1個進行測序。研究人員將1.95Gb的測序數據（高達105倍覆蓋率）與玉米基因組和轉基因載體的序列進行比對，確定了轉基因株系的插入位點，并用PCR擴增和Sanger測序進行了驗證。最后結果表明，轉基因玉米SbSNAC1-382的兩個拷貝的外源T-DNA片段是整合在了5號染色體177155650～177155696位置處。

SMRT技術成功應用于復雜轉化體插入位點和側翼序列的鑒定，為轉基因玉米的分子育種和安全評價提供了有效方案。