蔓荊子炮制前后HPLC指紋圖譜比較研究

李國衛，吳文平，索彩仙，孫冬梅，何民友，潘禮業

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham.或蔓荊VitextrifoliaL.的干燥成熟果實。秋季果實成熟時采收，除去雜質，曬干[1]。炒蔓荊子用藥始見于《圣惠》，以微炒居多，以除去宿萼及白膜等非藥用部位，使之飲片碎制、凈制，尚有緩和藥性、便于制劑、達到易于煎出有效物質的目的[2]。蔓荊子具有疏散風熱、清利頭目的功效，炒制之后功效側重于升清陽之氣，較多的運用于耳目失聰及風濕痹痛的治療[3]。

蔓荊子的化學成分主要包括揮發油、雙萜類化合物、黃酮類化合物、氨基酸、脂肪酸等[4-9]。2015年版《中國藥典》以蔓荊子黃素作為蔓荊子與炒蔓荊子的定量分析指標。文獻研究顯示，蔓荊子炮制后黃酮類成分含量會下降，而水溶性浸出物會增加，因此采用蔓荊子黃素作為蔓荊子炮制的質量控制標準不能全面反映蔓荊子炮制品的質量[8,10-11]。為進一步研究炮制前后蔓荊子化學成分變化，并有效地控制其飲片的質量，本研究采用高效液相色譜法對蔓荊子、炒蔓荊子指紋圖譜進行了研究，為更好地控制蔓荊子和炒蔓荊子的藥材質量提供依據。

1 材料與儀器

WatersARC高效液相色譜儀(Waters公司)；Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；ME204E萬分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百萬分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS28型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct超純水系統(默克股份有限公司)。

異葒草苷(質量分數94.0%，批號：111974-201401)、蔓荊子黃素(質量分數99.7%，批號：111554-201304)、香草酸(質量分數99.80%，批號：110776-201503)均由中國食品藥品檢定研究所提供；磷酸、乙腈為色譜純(默克股份有限公司)；水為超純水(實驗室自制)；其他試劑為分析純。

17批蔓荊子樣品來源于江西、云南、湖北、廣東等地，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham. 或蔓荊VitextrifoliaL.的干燥成熟果實，炒蔓荊子為實驗室自制，樣品留存于廣東一方制藥有限公司質量中心，其中生品編號為：S1～S17，對應的炒蔓荊子編號為：PS1～PS17。

2 方法與結果

2.1 炒蔓荊子的制備

取蔓荊子200 g，按2015年版《中國藥典》炒蔓荊子項下規定：取凈蔓荊子，照清炒法(通則0213)微炒，炒至表面黑褐色，氣特異而芳香，味淡、微辛，符合2015年版《中國藥典》中炒蔓荊子的性狀特征[1]。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫(0～30 min，5%→20%A；30～40 min，20%→45%A；40～50 min，45%→95%A；50～60 min，95%A)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為258 nm；進樣體積為10 μL。

2.3 對照品溶液的制備

取蔓荊子黃素對照品、異葒草苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含蔓荊子黃素103.189 5 μg、異葒草苷114.539 0 μg的混合對照品溶液，即得；另取香草酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含40.538 8 μg的香草酸對照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取蔓荊子樣品粉末(過三號篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%(體積分數，下同)乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取上述蔓荊子供試品溶液、混合對照品溶液依次進樣檢測，考察實驗方法的專屬性。結果表明，樣品中各個色譜峰不受空白溶劑的干擾，其中蔓荊子黃素、異葒草苷、香草酸的保留時間與對照品色譜峰的保留時間一致，表明該方法具有良好的專屬性，結果見圖1。

5.香草酸； 8.異葒草苷； 14.蔓荊子黃素； A.香草酸對照品溶液； B.蔓荊子黃素與異葒草苷混合對照品溶液； C.蔓荊子供試品溶液； D.炒蔓荊子供試品溶液。

圖1 對照品與供試品溶液HPLC圖

Figure 1 The HPLC spectra of the mixed reference substance and the sample

2.5.2 精密度試驗 精密吸取“2.4”項下同一供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，以蔓荊子黃素為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.02%～0.11%、0.13%～0.53%，表明分析方法精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一蔓荊子樣品，按“2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，以蔓荊子黃素為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.03%～0.13%、0.89%～1.86%，表明方法重復性較好。

2.5.4 穩定性試驗 取精密吸取“2.4”項下同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項下色譜條件測定，以蔓荊子黃素為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.03%～0.17%、0.22%～0.50%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6 蔓荊子藥材指紋圖譜的建立

2.6.1 共有峰的確定 精密稱取不同批次蔓荊子及炒蔓荊子約0.5 g，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下的色譜條件依次進樣測定，以峰面積大于總峰面積的0.35%篩選色譜峰，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)”進行匹配，共得到15個穩定的共有峰，具有指紋圖譜特征性，可初步擬定為蔓荊子的指標成分群，分別得到蔓荊子及炒蔓荊子的指紋圖譜，見圖2、圖3。經對照品對照，5號峰為香草酸峰，8號峰為異葒草苷峰，14號峰為蔓荊子黃素峰。蔓荊子黃素峰因分離效果好、出峰穩定，選定為參照峰。以14號峰蔓荊子黃素峰為參照峰，計算各批蔓荊子與炒蔓荊子的共有峰的相對峰面積，結果見表1?？梢?，各共有峰的RSD值范圍為22.86%～87.86%，較為穩定，具有特征圖譜特征性，可初步定為蔓荊子的指標成分群。

2.6.2 蔓荊子和炒蔓荊子相似度計算 分別通過17批蔓荊子和17批炒蔓荊子生成的共有模式為對照指紋圖譜，計算各批次之間的相似度，結果見表2?？梢?，17批蔓荊子的相似度在0.850～0.999之間，17批炒蔓荊子的相似度在0.894～0.997之間，說明蔓荊子與炒蔓荊子的質量穩定，生品與生品、炮制品與炮制品之間成分組成差異小。

5.香草酸； 8.異葒草苷； 14.蔓荊子黃素； S1～S17分別為17批蔓荊子生品。

圖2 17批蔓荊子生品HPLC指紋圖譜疊加圖

Figure 2 Superposition chart of HPLC specific chromatograms of 17 batches of Viticis Fructus

5.香草酸； 8.異葒草苷； 14.蔓荊子黃素； S1～S17分別為17批炒蔓荊子樣品。

圖3 17批炒蔓荊子樣品HPLC指紋圖譜疊加圖

Figure 3 Superposition chart of HPLC specific chromatograms of 17 batches of fried Viticis Fructus

表1 蔓荊子生品及炒蔓荊子樣品指紋圖譜相對峰面積分析結果Table 1 Relative peak area of characteristic spectrum of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

表1 (續)

注：S1～S17為蔓荊子生品，PS1～PS17為炒蔓荊子。

表2 蔓荊子生品及炒蔓荊子指紋圖譜相似度結果Table 2 Similarity of fingerprints of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

注：S1～S17為蔓荊子生品，PS1～PS17為炒蔓荊子。

2.6.3 蔓荊子與炒蔓荊子各特征峰相對峰面積差異分析 對蔓荊子及炒蔓荊子特征圖譜的相對峰面積進行直觀分析，結果見圖4?？梢?，17批蔓荊子與炒蔓荊子特征圖譜的15個共有峰中，峰6、峰7、峰8、峰9、峰13等5個色譜峰的相對峰面積呈整體降低趨勢；峰1、峰2、峰3、峰5、峰15等5個色譜峰的相對峰面積呈整體增大趨勢；峰4、峰10、峰11等3個色譜峰的相對峰面積則有升有降，無明顯規律。運用SPSS 20.0軟件對蔓荊子及炒蔓荊子各特征峰峰面積進行獨立樣本t檢驗，結果見表3?？梢?，峰2、峰6、峰7、峰15的相對峰面積存在明顯差異(P<0.05)?；诮y計分析結果與直觀分析結果一致，說明蔓荊子與炒蔓荊子的成分比例存在差異。

MJZ.蔓荊子生品；CMJZ.炒蔓荊子。

A.峰1、峰2、峰3、峰5、峰15相對峰面積均值圖； B.峰6、峰7、峰8、峰9、峰13相對峰面積均值圖。

圖4 蔓荊子及炒蔓荊子相對峰面積均值對比圖

Figure 4 Comparison charts of relative peak area mean of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

3 討論

本研究采用全波長掃描(190～400 nm)確定檢測波長，結果顯示在258 nm波長下色譜峰數目最多，色譜峰分離度較好，故測定波長選擇258 nm，并最終建立蔓荊子及炒蔓荊子指紋圖譜；并對不同提取方法(超聲、回流)及不同提取溶劑(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇)進行比較，結果發現采用50%乙醇回流提取的色譜圖信息量最多，峰響應較高，故選用50%乙醇回流提取。

表3 蔓荊子及炒蔓荊子各特征峰相對峰面積獨立樣本檢驗結果

Table 3 The independent sample test result of relative peak area of each characteristic peak of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

峰號t值dfP值峰1-1.98832峰2-2.77132<0.05峰3-1.93432峰40.82332峰5-0.45032峰64.37832<0.05峰73.09032<0.05峰80.87232峰90.70332峰100.56932峰110.89032峰12-0.69032峰130.88332峰15-6.32432<0.05

本研究結果顯示，17批蔓荊子與炒蔓荊子特征圖譜的15個共有峰中，峰6、峰7、峰8、峰9、峰13等5個色譜峰的相對峰面積呈整體降低趨勢；峰1、峰2、峰3、峰5、峰15等5個色譜峰的相對峰面積呈整體增大趨勢；峰面積出現明顯變化的色譜峰主要集中在特征圖譜前30 min的部分，其中峰5為香草酸，峰8為異葒草苷，前30 min的成分多為極性較大的水溶性成分，與文獻研究的水溶性浸出物會增加的結論有一定關聯[10]；但黃酮類成分異葒草苷相對峰面積呈現降低趨勢，提示蔓荊子中部分黃酮類成分炮制后含量可能會降低。

2015年版《中國藥典》蔓荊子項下并未對蔓荊子、炒蔓荊子進行系統的鑒別，本實驗通過對不同產地蔓荊子、炒蔓荊子的指紋圖譜進行分析，為蔓荊子及炒蔓荊子的質量標準制定、品質評價提供一定的科學依據，為蔓荊子的質量控制提供了參考方法。本研究尚未對炮制前后產生變化的成分進行深入研究，后續將針對炮制后產生變化的化學成分進行指認，并開展蔓荊子炮制前后藥效對比研究，進一步揭示蔓荊子炒制的科學內涵。