高產monacolin K或色素紅曲菌發酵米糠及碎米的研究

吳雙雙，馮艷麗～4

(1.湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學 生物學國家級實驗教學示范中心，湖北 黃石 435002；3.特色野菜良種繁育與綜合利用技術湖北省工程研究中心，湖北 黃石 435002；4.湖北師范大學 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002)

0 前言

紅曲菌(Monascusspp.)，又稱紅曲霉，是一類小型絲狀真菌，是中國重要的可食用微生物資源[1，2]。紅曲菌的發酵產物——紅曲最早在中國發現，其生產及應用歷史長達近2000年[3]。以大米等富含淀粉的原料為培養基，接種紅曲菌后可發酵制成紅曲，它既可食用也可作藥用[4，5]。紅曲菌可產生多種有益次生代謝產物，主要包括莫納可林K(monacoin K，MK)，紅曲色素(Monascuspigments，MPs)、麥角固醇及γ-氨基丁酸等。但是，部分紅曲菌株還可產生腎毒素——桔霉素[6，7]。目前，對紅曲菌代謝產物研究和應用最為廣泛的是MPs和MK。

MPs不僅熱穩定性及蛋白著色力強、對pH穩定，它還因安全無毒被用作天然食品著色劑[6，7]。MK可有效減少或阻斷人體膽固醇的合成，從而調節人體血壓和血脂[8～10]。桔霉素是部分種屬的紅曲菌在代謝過程中產生的真菌毒素，具有腎毒性，還可能致畸、誘發腫瘤、致突變等[11～13]。眾所周知，發酵基質對微生物生長及代謝具有重要意義。在紅曲發酵過程中，若采用價格低廉的農業副產物作為基質進行發酵，從而獲取高附加值的MPs或MK，可在大幅降低生產成本的同時，強化農副產物的綜合利用[14]。

米糠是稻谷加工過程中的重要副產物，它依附在糙米的表層，主要由外果皮、中果皮、交聯層、種皮和糊粉層組成[15]。雖然米糠的重量約為稻谷總重的6%，但稻米60%的營養成分存在于米糠中，且含有90%以上人體必需的微量元素[16]。米糠中的常規營養成分主要包括脂肪、蛋白質、糖類、維生素和礦物元素等。另外，米糠還含有角鯊烯、必需脂肪酸和神經酰胺等近百種功能因子，具有預防心血管疾病、腫瘤及調節血糖等功能[17，18]。我國米糠年產量約1 200萬噸，但其利用率極低，還不足20%.目前，米糠主要用于飼料加工，還有部分用于植酸、肌醇、米糠油等的開發，利用率及利用范圍有待提高和擴展[19]。

我國是世界上第一稻米生產大國，世界上34%的稻米產自我國[20]。在稻米的加工過程中，占稻米產量10%～15%的副產物為碎米，每年可產生約3 000萬噸碎米。碎米的主要成分與大米十分相似，主要包括約75%的淀粉和約8%的蛋白質及少量生理活性物質和脂類物質。此外，碎米中還含有大量礦物元素和維生素B族[21]，但碎米價格卻比大米便宜一半甚至更多[20]。然而，我國的碎米資源利用率較低。目前主要利用碎米制作新脂肪替代物、多孔淀粉、抗性淀粉等[20]，獲取碎米蛋白[22]，研制米面包、米飲料、米粉、人造米等[23]。

鑒于已有的文獻和現有的研究基礎，以前期實驗過程中誘變得到的可高產MK的紅曲菌ZWN2及可高產MPs的紅曲菌ZWS5為實驗菌株，以米糠或碎米為基礎培養基，對上述兩株紅曲菌發酵米糠或碎米產MK或MPs的工藝條件進行優化。以期通過該研究，為后續進一步拓寬米糠和碎米的綜合利用途徑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 可高產MK的紅曲菌ZWN2及可高產MPs紅曲菌ZWS5，是以叢毛紅曲菌(Monascuspilosus)MS-1(CCTCC M 2013295，中國典型培養物保藏中心，武漢)為出發菌株誘變獲得。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養基[24]：稱取200 g去皮馬鈴薯，切塊至大小約為邊長為2 cm的正方體，添加1 000 mL的蒸餾水并煮沸20 min，經8層紗布過濾，加入20 g瓊脂粉并加熱攪拌至完全溶解，后加入20 g葡萄糖并攪拌至溶解，冷卻后以蒸餾水定容至1 000 mL.

種子液培養基[24,25]：葡萄糖80 g，蛋白胨10 g，NH4H2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，土豆汁(PDA培養基不添加葡萄糖及瓊脂粉)1 000 mL.

固態培養基組分及發酵參數[26]：優化培養基中的基礎培養基為米粉和豆粉，其比例為3∶2，原始培養基的基礎培養基為純米粉。每個250 mL三角瓶中加入上述基礎培養基50 g，培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量分別調整為35%(w/w)，0.6%(v/w)和0.004 mol/kg，混勻后滅菌并趁熱打散。

上述培養基均在121 ℃條件下滅菌20 min.

1.1.3 試劑 葡萄糖：重慶和平制藥有限公司；無水氯化鈣、冰乙酸、磷酸二氫銨、七水硫酸鎂、無水氯化鋰及無水乙醇均為分析純試劑，蛋白胨及瓊脂粉均為生物試劑，乙腈及磷酸均為色譜純試劑，上述試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；MK標準品(純度≥98%)：購于阿拉丁公司；大豆分離蛋白及大豆異黃酮(純度80%)，購于河南千志商貿有限公司，純凈水、土豆：市售。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：UV-5 100 B，上海元析儀器有限公司；高效液相色譜儀：Agilent 1 260，安捷倫科技有限公司；其它均為實驗室常規儀器。

1.3 方法

1.3.1 種子液的培養及固態發酵 取15 mL無菌水，加入在30 ℃培養10 d的紅曲菌茄形瓶中，用接種鏟將茄形瓶中的紅曲菌孢子洗入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中打散。將上述紅曲菌孢子懸液接入種子液培養基，控制接種量為10%(v/v).將種子液置于30 ℃、130 r/min培養36 h.在進行紅曲固態發酵時，控制種子液的接種量為13%(v/w)，在30 ℃培養3 d后調整溫度至25 ℃，繼續培養至14 d(該發酵條件主要用于紅曲菌產MK，若用于紅曲菌產MPs則將培養基置于30 ℃培養14 d).將發酵產物置于55 ℃烘干12 h后粉碎并過80目篩備用[26]。

1.3.2 紅曲菌發酵產物的色價檢測 采用分光光度法測定紅曲菌發酵產物的色價[24]。在50 mL離心管中加入0.3 g粉碎后的紅曲菌發酵產物和10 mL 75%乙醇，充分振蕩、勻混后超聲提取1 h.在室溫靜置15 min后取上清液，于8 000 r/min離心10 min，取上清液待用。將上述所得上清液用75%乙醇稀釋至適宜的濃度，以確保其OD505nm值在0.2～0.8之間，用75%的乙醇作為空白對照，調整分光光度計波長至505 nm，測定吸光度值。紅曲菌發酵產物的色價計算公式為：

1.3.3 紅曲菌發酵產物中MK的檢測 以優化后的高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)法分析紅曲菌發酵產物中的MK含量及MK和MPs同系物的種類[26,27]。MK的提取同1.3.2中MPs的提取。取離心后的紅曲菌發酵產物提取液，用75%乙醇稀釋至適宜濃度，使樣品中MK的濃度與標樣中MK的濃度盡量接近。采用微孔有機濾膜(0.22 μm)過濾樣液后備用。采用Agilent 1 260的HPLC系統，Inertsil ODS-3的色譜柱，乙腈∶水∶0.5%磷酸=60∶37∶3作為流動相，控制流速、柱溫和檢測波長分別為1.0 mL/min、25 ℃及238 nm，進樣量設置為20 μL(若進行MPs同系物的監測，則主要觀察505 nm，460 nm和390 nm，分別代表紅色素、橙色素和黃色素)。紅曲菌發酵產物中MK含量的計算公式如下：

1.3.4 發酵基質對紅曲菌ZWN2產MK及MPs的影響 分別采用大米、米粉:豆粉(3∶2)、米糠和碎米粉為基礎發酵基質，分別調整培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量為35%(w/w)，0.6%(v/w)和0.004 mol/kg.接種量控制在13%(v/w)，接種后的培養物在30 ℃培養3 d，再調整溫度至25 ℃并培養至14 d[26].采用1.3.2和1.3.3中所述的方法分析發酵產物中的MK及MPs.分別以MK及MPs的產量作為考察指標，選取適合紅曲菌產MK或MPs的基礎培養基。

1.3.5 刺激物對紅曲菌產MK及MPs的影響

1.3.5.1 刺激物對紅曲菌ZWN2在米糠中產MK及MPs的影響

課題組已有的研究結果(數據未列出)指出，大豆異黃酮、葡萄糖及大豆分離蛋白對紅曲菌產MK及MPs均影響顯著。在1.3.4中篩選所得適合產MK的基礎培養基中分別添加不同的刺激因子，主要包括：大豆分離蛋白(5%)、大豆異黃酮(3%)、葡萄糖(3%)，大豆分離蛋白+大豆異黃酮(5%+3%)、大豆分離蛋白+葡萄糖(5%+3%)、大豆異黃酮+葡萄糖(3%+3%)和大豆分離蛋白+大豆異黃酮+葡萄糖(5%+3%+3%)(w/w)，調整培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態發酵參數同1.3.1.紅曲菌發酵產物中MK及MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3該實驗的目的是篩選促進紅曲菌ZWN2產MK的刺激物。

1.3.5.2 刺激物對紅曲菌ZWS5在碎米中產MPs的影響

在1.3.4篩選所得的MPs基礎培養基中分別添加刺激因子，主要包括：大豆分離蛋白(5%)、大豆異黃酮(3%)、葡萄糖(3%)，大豆分離蛋白+大豆異黃酮(5%+3%)、大豆分離蛋白+葡萄糖(5%+3%)、大豆異黃酮+葡萄糖(3%+3%)和大豆分離蛋白+大豆異黃酮+葡萄糖(5%+3%+3%)(w/w)，調整培養基中水分、冰乙酸、MgSO4·7H2O含量及接種量同1.3.4，在30 ℃培養至14 d，發酵產物處理方法同1.3.1.紅曲菌發酵產物中MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3.該實驗的目的是篩選促進紅曲菌ZWS5產MPs的刺激物。

1.3.6 刺激物添加量對紅曲菌產MK及MPs的影響

1.3.6.1 刺激物添加量對紅曲菌ZWN2產MK及MPs的影響

在1.3.4篩選出的適合紅曲菌產MK基礎培養基中添加不同量的由1.3.5.1篩選所得的刺激物，調整培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態發酵參數同1.3.1.紅曲菌發酵產物中MK及MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3.該實驗的目的是篩選促進紅曲菌ZWN2產MK刺激物的適宜添加量。

1.3.6.2 刺激物添加量對紅曲菌ZWS5產MPs的影響

在1.3.4篩選出的適合紅曲菌產MPs基礎培養基中添加不同量的由1.3.5.2篩選所得的刺激物，調整培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態發酵參數同1.3.5.2.紅曲菌發酵產物中MPs的分析方法同1.3.2.該實驗的目的是篩選促進紅曲菌ZWS5產MPs刺激物的適宜添加量。

1.3.7 優化后米糠及碎米培養基與優化培養基產MK及MPs對比分析

1.3.7.1 紅曲菌ZWN2在優化后米糠培養基與優化培養基中產MK對比分析

將紅曲菌ZWN2分別接種于1.3.6.1篩選所得的培養基和優化培養基進行固態發酵[26]，調整培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態發酵參數同1.3.1.紅曲菌發酵產物中MK及MPs的分析方法同1.3.2和1.3.3.該實驗的目的是分析ZWN2在不同培養基中產MK能力。

1.3.7.2 紅曲菌ZWS5在優化后碎米培養基與純大米培養基中產MPs對比分析

將ZWS5分別接種于1.3.6.2實驗篩選所得的培養基和純大米培養基進行固態發酵，調整培養基中水分、冰乙酸及MgSO4·7H2O含量同1.3.4，紅曲菌的接種及固態發酵參數同1.3.5.2.紅曲菌發酵產物中MPs的分析方法同1.3.2.該實驗主要是分析紅曲菌ZWS5在不同培養基中產MPs的能力。

2 結果與討論

2.1 發酵基質對紅曲菌ZWN2產MK及MPs的影響

將紅曲菌ZWN2分別接種于以大米、米粉∶豆粉(3∶2)、米糠和碎米粉為基礎培養基的培養基中固態發酵，分析紅曲菌發酵產物中的MPs及MK，結果如圖1所示。

圖1 培養基對紅曲菌ZWN2菌株產MPs和MK的影響

由圖1可知，對4種培養基產MPs和MK的情況進行對比分析。結果表明，4種培養基產MPs和MK的組間差異均呈極顯著差異(p值分別為0.000026和0.000015).證明基礎培養基的類型對紅曲菌產MPs和MK均呈極顯著影響(p<0.001).同等條件下，碎米更適于紅曲菌產MPs而米糠更適宜紅曲菌產MK.究其原因，可能是由于米糠中含有大量的生理活性物質和微量元素，與前期優化的米加豆的混合基礎培養基相比，更適宜紅曲菌的生長和MK的產生[28]。在MPs的產生方面，碎米的組分雖與大米非常相似，但碎米中含有的豐富礦物元素和維生素B族更利于紅曲菌產MPs[21].在后續實驗中，以米糠作為紅曲菌產MK的基礎培養基，以碎米作為紅曲菌產MPs的基礎培養基。

2.2 刺激物對紅曲菌產MK及MPs的影響

2.2.1 刺激物對紅曲菌ZWN2在米糠中產MK及MPs的影響 將不同組合和比例的大豆分離蛋白、葡萄糖及大豆異黃酮添加至由2.1篩選所得的米糠培養基中，考察刺激物對紅曲菌ZWN2在米糠培養基中產MPs和MK的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，所添加的3種刺激物對紅曲菌ZWN2產MPs均有一定程度的抑制作用。在對紅曲菌產MK的影響方面，當添加5%大豆分離蛋白或3%大豆異黃酮時，對紅曲菌ZWN2產MK具有一定的促進作用，但效果不顯著，這與前期研究結果并非完全相符(數據未列出)。造成該現象的原因可能是該刺激物的添加量并不適于紅曲菌ZWN2產MPs或MK.后續實驗中，采用大豆異黃酮和大豆分離蛋白繼續探討它們促進紅曲菌ZWN2產MK的最適添加量。

1：米糠空白對照；2∶5%大豆分離蛋白；3∶3%大豆異黃酮；4∶3%葡萄糖；5∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮；6∶5%大豆分離蛋白+3%葡萄糖；7∶3%大豆異黃酮+3%葡萄糖；8∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮+3%葡萄糖。

2.2.2 刺激物對紅曲菌ZWS5在碎米中產MPs的影響 根據2.1的實驗結果，碎米作為基礎培養基適宜紅曲菌產MPs.在碎米培養基中添加不同刺激物，考察刺激物對紅曲菌ZWS5產MPs的影響，結果如圖3和表1所示。

圖3 刺激物對紅曲菌ZWS5在碎米中產MPs的影響

1：碎米空白對照；2∶5%大豆分離蛋白；3∶3%大豆異黃酮；4∶3%葡萄糖；5∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮；6∶5%大豆分離蛋白+3%葡萄糖；7∶3%大豆異黃酮+3%葡萄糖；8∶5%大豆分離蛋白+3%大豆異黃酮+3%葡萄糖。

表1 刺激物對紅曲菌ZWS5在碎米中產MPs同系物的影響

由圖3可知，在碎米培養基中添加3%大豆異黃酮或者3%大豆異黃酮+3%葡萄糖均可顯著促進對紅曲菌ZWS5產MPs(p3=0.024831，p7=0.034962，p<0.05)，但二者之間無顯著性差異(p=0.670057>0.05)，選擇3%大豆異黃酮作為促進紅曲菌ZWS5產MPs的適宜刺激物。由表1可知，刺激物不僅可影響紅曲菌產MPs的產量，還可影響MPs的同系物種類。添加大豆分離蛋白的紅曲發酵產物中紅色素的同系物種類的數量少于對照，橙色素同系物種類有所增加，黃色素同系物種類基本沒有變化。葡萄糖或大豆異黃酮對紅曲菌發酵產物中紅、橙、黃色素同系物種類影響不明顯。上述現象可能是刺激物的添加影響了MPs的合成途徑造成的，這與已有文獻報道類似[29]。

2.3 刺激物的添加量對紅曲菌產MK及MPs的影響

2.3.1 刺激物添加量對紅曲菌ZWN2產MK及MPs的影響 結合2.2.1的結果，篩選獲得大豆分離蛋白和大豆異黃酮作為促進紅曲菌ZWN2產MK的刺激物，在米糠培養基中分別添加不同量的大豆分離蛋白和大豆異黃酮，考察其對紅曲菌ZWN2產MK的影響，結果如圖4和圖5所示。

大豆分離蛋白添加量(%)

大豆分離蛋白添加量(%)

圖4 大豆分離蛋白添加量對紅曲菌ZWN2在米糠中產MPs及MK的影響

大豆異黃酮添加量(%)

大豆異黃酮添加量(%)

圖5 大豆異黃酮添加量對紅曲菌ZWN2在米糠中產MPs及MK的影響

由圖4可知，大豆分離蛋白對紅曲菌ZWN2產MPs具有顯著抑制作用(p<0.05)，該結果與課題組前期研究結果相符(數據未列出)。當培養基中大豆分離蛋白添加量為3%時，紅曲菌ZWN2發酵米糠所得產物中MK的量最高，達12.14 mg/g.與對照組(6.39 mg/g)相比，MK的產量提高了89.98%.由圖5可知，當大豆異黃酮的添加量較小(<4%)時，對紅曲菌ZWN2 產MPs呈抑制作用。當大豆異黃酮的添加量達到4%或5%時，ZWN2發酵產物中MPs產量有所提高，且大豆異黃酮添加量為5%時，其發酵產物的色價顯著高于大豆異黃酮添加量為4%時的色價(0.010.05).綜合圖4和圖5，選擇添加3%大豆分離蛋白作為紅曲菌ZWN2發酵米糠產MK的適宜添加量。

2.3.2 刺激物添加量對紅曲菌ZWS5產MPs的影響 根據2.2.2的實驗結果，篩選獲得大豆異黃酮用作促進紅曲菌ZWS5產MPs的刺激物。以碎米為基礎培養基，分別調整其中大豆異黃酮的添加量呈濃度梯度，考察大豆異黃酮的添加量對紅曲菌ZWS5產MPs的影響，結果如圖6所示。

大豆異黃酮添加量(%)

由圖6可知，當大豆異黃酮的添加量為1%和3%時，均可顯著促進紅曲菌ZWS5在碎米中產MPs(p1=0.029462<0.05和p3=0.045869<0.05)，所得發酵產物的色價可達918.4 U/g和886.4 U/g.與對照組純碎米發酵產物的色價675.2 U/g相比，分別提高36.02%和31.28%.但大豆異黃酮的添加量為1%或3%時，兩者所得發酵產物的色價之間無顯著差異(p=0.656778>0.05).故選擇添加1%的大豆異黃酮作為紅曲菌ZWS5發酵碎米產MPs的適宜添加量。

2.4 優化后米糠及碎米培養基與優化培養基產MK及MPs對比分析

結合2.3.1的實驗結果，篩選出3%大豆分離蛋白作為紅曲菌ZWN2產MK的適宜添加量。在優化培養基即米豆混合培養基、米糠培養基和優化后的米糠培養基即添加3%的大豆分離蛋白中分別接入紅曲菌ZWN2，對比分析不同培養基對紅曲菌ZWN2產MK能力的影響，結果如圖7所示。

由圖7可知，紅曲菌ZWN2分別在3種培養基即優化培養基即米豆混合培養基、米糠培養基和優化后的米糠培養基即米糠+3%大豆分離蛋白中均發酵14 d，紅曲菌ZWN2發酵優化后的米糠培養基所得發酵產物中MK產量最高，為11.68 mg/g.該MK產量與優化培養基的發酵產物中MK產量5.86 mg/g相比提高99.32%.

結合2.3.2的實驗結果，篩選后以1%大豆異黃酮作為紅曲菌ZWS5產MPs的適宜添加量。在純大米、碎米和優化后的碎米等培養基中分別接種紅曲菌ZWS5，探究培養基對紅曲菌ZWS5產MPs能力的影響，結果如圖8所示。

圖8 培養基對紅曲菌ZWS5產MPs的影響

由圖8可知，紅曲菌ZWS5在3種培養基中發酵14 d，紅曲菌ZWS5發酵碎米優化培養基所得發酵產物中MPs產量最高，達到981.33 U/g.與紅曲菌ZWS5發酵純大米培養基所得發酵產物的色價560 U/g相比，提高75.24%.

以HPLC法分析MK含量時，采用酸式和內酯式MK標準溶液作為對照，計算紅曲菌發酵產物中MK的含量。酸式及內酯式MK和紅曲發酵產物提取液樣品的色譜圖如圖9所示。

由圖9可知，酸式MK和內酯式MK的出峰時間分別在11 min和21 min左右，紅曲菌發酵產物中的MK主要以酸式和內酯式存在，且以酸式結構為主。但根據行業標準QB/T2847-2007，目前對紅曲發酵產物中MK的定量，是以內酯式MK作為計算依據。對MK的檢測過程中，應根據不同批次樣品中MK的含量對樣品進行適當的稀釋或調整標準品的濃度，確保MK標準品的濃度與樣品中MK的濃度盡量接近。

3 結論

將紅曲菌ZWN2和ZWS5用于米糠及碎米的固態發酵產生MK或MPs，對其發酵工藝參數進行優化。1)紅曲菌ZWN2發酵米糠產MK的適宜條件為：在米糠基礎培養基中添加大豆分離蛋白，添加量為3%.調整培養基中水分、乙酸及MgSO4·7H2O含量分別為35%，0.6%(v/w)和0.004 mol/kg，控制種子液的接種量為13%(v/w).在30 ℃培養3 d，調整溫度至25 ℃并繼續培養至14 d.此時，紅曲菌ZWN2發酵產物中MK含量達11.68 mg/g.2)ZWS5發酵碎米產MPs的適宜條件為：在碎米基礎培養基中添加大豆異黃酮，添加量為1%.調整培養基中水分、乙酸、MgSO4·7H2O含量及接種量與米糠紅曲相同。在30 ℃培養14 d，紅曲菌ZWS5發酵產物的色價可達981.33 U/g.該研究結果可為后續進一步拓寬米糠和碎米的綜合利用途徑提供借鑒。