桑寄生提取物對人結腸癌HT-29細胞侵襲遷移的影響及作用機制

馮海洋 劉卓 付志璇

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來發病率居高不下，在全世界位居第三，我國發病率和死亡率也逐年升高[1-2]。對于結腸癌的治療，目前采用以外科手術為主、化療為輔的綜合治療方式，但是療效并不理想，且藥物毒副反應較大，腫瘤耐藥明顯，對患者的生存率提高不明顯[3]。此外，臨床上很大一部分患者在診斷結腸癌時已出現遠處轉移，失去了手術機會，治療困難?？梢?，結腸癌的預后與是否發生轉移密切相關[4]。因此，針對結腸癌侵襲轉移的基礎研究及藥物研究，是當前結腸癌研究領域的熱點。桑寄生富含茶酸、齊墩果酸、香樹脂醇、黃酮類化合物、槲皮素和凝集素等有效成分，目前已被證實具有抗腫瘤、降血壓、消炎鎮痛及保護神經等作用[5]。為進一步探討桑寄生的抗腫瘤作用機制，本研究就桑寄生提取物對人結腸癌HT-29細胞增殖及侵襲遷移的影響作一探討，并闡釋其可能的作用機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑 人結腸癌HT-29細胞（中國科學院上海生物細胞研究所）。桑寄飲片（安徽淮濤中藥片科技有限公司）。DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；細胞計數試劑盒（CCK-8，日本同仁化學公司）；侵襲小室（Transwell）及基質膠Matrigel（美國BD公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及SDS-PAGE膠試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；兔抗人基質金屬蛋白酶 2（MMP-2）、MMP-9、血管內皮生長因子（VEGF）、鼠抗人AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K抗體（美國 Abcam公司）；GAPDH、HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG（杭州華安生物有限公司）；ECL發光檢測試劑盒（美國賽默飛公司）。

1.2 桑寄生提取物制備 稱取桑寄生飲片1 000g，蒸餾水沖洗2次，加入5 000g蒸餾水浸泡1h，文火煎煮30min；過濾，取濾液，殘渣加入2 000g蒸餾水繼續煎煮30min；再次提取濾液，合并兩次濾液并旋轉蒸發濃縮至100ml膏狀提取物（相當于每ml含桑寄生藥材10g），置于4℃冰箱冷藏備用。實驗前取桑寄生提取物，用培養液倍比稀釋制備相應實驗濃度，0.22μm無菌濾器過濾后使用。

1.3 細胞培養 用DMEM培養基（內含10%胎牛血清、100g/L青霉素及100g/L鏈霉素）在37℃、5%CO2培養箱中培養人結腸癌HT-2細胞，待細胞生長至對數期進行傳代及實驗。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將對數生長期的HT-29細胞，用胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，以3 000個/孔接種于96孔培養板中，分為6組，每組設置3個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜；吸取上清后，6 組分別在每孔加入 0、0.5、1、2、4、8g/ml濃度的桑寄生提取物100μl；分別于加藥24、48、72h后，加入CCK-8試劑（10μl/孔），放入培養箱繼續培養4h。利用分光光度計檢測各孔在550nm的吸光度（OD值），細胞存活率（%）=OD 值加藥組/OD 值空白對照組×100%，并計算細胞的半數抑制濃度（IC50）。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。用無血清DMEM培養液按3∶1比例稀釋基質膠，取30μl基質膠稀釋液均勻包被Transwell小室，于4℃過夜、風干，置于24孔培養板備用；HT-29細胞經不同濃度桑寄生提取物（0、0.5、1、2g/ml）處理 24h 后，以 5×104個/200μl接種至Transwell上室，下室加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培養液，在37℃、5%CO2培養箱中培養24h；棉簽擦掉基質膠和上室底層細胞，4%多聚甲醛固定10min，磷酸緩沖鹽溶液洗3次，0.1%結晶紫染液染色20min；取小室并在用清水洗凈、晾干；在顯微鏡下拍照，隨機選取5個視野計數細胞數，取平均值；計算桑寄生對HT-29細胞的侵襲抑制率，抑制率=（1-藥物組細胞數/對照組細胞數）×100%。

1.6 細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。取對數生長期的HT-29細胞懸液，接種于6孔板內；將培養板置于培養箱內培養過夜；細胞長滿后，用微量槍頭劃線；并設置0、0.5、1、2g/ml桑寄生提取物藥物處理組，加藥后繼續培養；在0、24h時點取樣，拍照。使用Image J軟件，計算細胞遷移率。

1.7 相關蛋白表達檢測 采用免疫印跡試驗。HT-29細胞按照上述1.5藥物分組處理48h；棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液潤洗細胞3遍，加入RIPA裂解液，將細胞與細胞裂解液收集于1.5ml離心管中；12 000g離心10min，取上清液；按BCA蛋白定量試劑盒操作，檢測各樣品蛋白濃度，加入5×Loading制樣，煮沸后每組取蛋白20μg上樣 SDS-PAGE 膠，電泳（80V，60～90min），轉膜（120V，2h）。取出膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2h；TBST清洗3次，加入一抗 4℃孵育過夜；TBST清洗3次，室溫孵育二抗2h；TBST再次清洗，利用ECL顯影并拍照。

1.8 統計學處理 采用GraphPad Prism 6.0統計軟件。計量資料用表示，不同劑量組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不同處理時間比較采用重復測量數據的方差分析，兩兩比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 桑寄生提取物對人結腸癌HT-29細胞增殖能力的影響 不同濃度（0、0.5、1、2、4、8g/ml）的桑寄生提取物處理細胞24、48、72h后，細胞存活率隨著濃度的增加或時間的延長而降低，呈時間劑量依賴性（均P＜0.05），見圖1。桑寄生提取物在24、48、72h對HT-29細胞的IC50依次為（6.1±0.2）、（3.5±0.3）、（2.2±0.2）g/ml。

2.2 桑寄生提取物對人結腸癌HT-29細胞侵襲能力的影響 HT-29細胞經1、2g/ml桑寄生提取物處理24h后，侵襲細胞數分別為（504±31）、（308±21）個，明顯低于空白對照組的（644±52）個，差異有統計學意義（P＜0.05）；而0.5g/ml桑寄生提取物處理組侵襲細胞數為（588±81）個，與空白對照組比較差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖2（插頁）。

圖1 不同濃度桑寄生提取物處理后HT-29細胞存活率

圖2 不同濃度桑寄生提取物對HT-29細胞侵襲能力的影響（a：Transwell小室實驗結果，×100；b：與空白對照組比較，*P＜0.05）

2.3 桑寄生提取物對人結腸癌HT-29細胞遷移能力的影響 經1、2g/ml桑寄生提取物處理24h后，HT-29細胞遷移率分別為（66.7±6.4）%、（26.7±3.1）%，較空白對照組（100.0±15.0）%明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；而0.5g/ml桑寄生提取物處理組細胞遷移率為（93.3±12.1）%，與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 3（插頁）。

圖3 不同濃度桑寄生提取物對HT-29細胞遷移能力的影響（a：劃痕修復實驗結果，×4；b：與空白對照組比較，*P＜0.05）

2.4 桑寄生提取物對HT-29細胞侵襲遷移相關蛋白表達的影響 經0.5、1、2g/ml桑寄生提取物處理48h后，HT-29細胞侵襲遷移相關蛋白（MMP2、MMP9及VEGF）相對表達量明顯低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 4。

2.5 桑寄生提取物對HT-29細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響 經0.5、1、2g/ml桑寄生提取物處理48h后，HT-29細胞PI3K、AKT蛋白相對表達量與空白對照組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而p-AKT、p-PI3K蛋白相對表達量明顯低于空白對照組（均 P＜0.05），見圖 5。

圖4 不同濃度桑寄生提取物對HT-29細胞內侵襲遷移相關蛋白表達的影響（a：電泳圖；b：與空白對照組比較，*P＜0.05）

圖5 不同濃度桑寄生提取物對HT-29細胞內PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響（a：電泳圖；b：與空白對照組比較，*P＜0.05）

3 討論

結腸癌患者預后及5年生存率，主要取決于癌細胞轉移與否[6]。因此，針對抑制結腸癌轉移的藥物研究具有重要意義。目前，桑寄生在臨床上已用于風濕痹痛、腰膝酸軟、頭暈目眩等疾病的治療。隨著對桑寄生有效成分的分析與研發，其在抗腫瘤方面的作用也被逐漸關注。如桑寄生總黃酮提取物能夠有效抑制人白血病細胞株HL-6的增殖[7]；桑寄生凝集素能夠有效抑制肝癌細胞株BEL-7402及胃癌細胞株MGC-823的增殖[8-9]。以上研究證明，桑寄生具有明確的抗腫瘤活性，但其作用機制并不清楚。為了進一步探討桑寄生的抗腫瘤活性及其作一機制，本研究以人結腸癌細胞株HT-29為細胞模型，觀察不同濃度桑寄生提取物對HT-29細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，并分析可能的分子機制。結果顯示桑寄生提取物能抑制人結腸癌HT-29細胞增殖、侵襲及遷移能力，同時下調細胞內侵襲遷移相關蛋白的表達，其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路有關。

細胞侵襲與轉移是一個復雜的過程，涉及多種信號通路及多種基因、細胞因子的調控[10-11]；因此，本研究從分子水平研究腫瘤細胞侵襲轉移相關的機制。近年來研究證明，細胞外基質的降解是腫瘤侵襲轉移的基礎，MMPs作為細胞外基質蛋白酶的主要組成部分，對細胞基質的重塑和降解起著重要作用[12]。腫瘤細胞從原位脫落，分泌MMP，其中MMP-2及MMP-9降解細胞周圍基質，是腫瘤細胞侵入血液及淋巴循環并向遠處遷移、從而形成新轉移灶的關鍵環節。研究表明，MMP-2、MMP-9與結腸癌的發生與轉移密切相關[12-13]。在本研究中，空白對照組HT-29細胞內MMP-2、MMP-9蛋白呈高表達，而桑寄生提取物處理后的HT-29細胞內MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量明顯降低，這說明桑寄生提取物能抑制人結腸癌HT-29細胞侵襲、轉移能力，可能與抑制其MMP-2、MMP-9蛋白表達有關。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，與腫瘤轉移密切相關；而VEGF途徑抑制劑已成為腫瘤治療的一種新治療手段[14]。本研究結果發現，桑寄生提取物能降低HT-29細胞內VEGF表達量，從而抑制腫瘤細胞侵襲與轉移。

PI3K/AKT信號通路是參與生命活動的關鍵信號通路，在腫瘤的發生、發展中起著重要作用[15]。研究表明，PI3K/AKT信號通路與結腸癌的發生、發展及化療耐藥等特性密切相關[16]。PI3K通過與其上游分子的作用引起PI3K結構變化，從而使AKT磷酸化而被激活，而活化的AKT通過調控其下游基因來參與腫瘤的增殖、侵襲等過程[15]。本研究結果顯示，桑寄生提取物處理后的HT-29細胞內p-PI3K及p-AKT蛋白相對表達量明顯降低，提示桑寄生提取物可能通過抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制人結腸癌細胞的侵襲與轉移。

綜上所述，桑寄生提取物能抑制人結腸癌HT-29細胞的增殖、侵襲及遷移，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關。