九香蟲水煎液主要成分分析及對乳腺癌細胞增殖的抑制作用

田 瑩，檀 軍,2，趙 帥，郭建軍*

(1.貴州大學昆蟲研究所，貴州山地農業病蟲害重點實驗室，貴陽 550025；2.遵義醫科大學，組織學與胚胎學教研室，貴州遵義 563000)

癌癥已經成為嚴重威脅人類生命健康的頭號殺手，且發病率和死亡率急劇上升(毛艷艷等，2016)?！?018年全球癌癥報告》顯示，乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，新增發病人數約210萬人，發病率和死亡率分別占女性癌癥患者的24.2%和15%，高居首位(Brayetal.,2018)。乳腺癌的防控與治療形勢嚴峻。

昆蟲類中藥在治療腫瘤中發揮重要的作用(林璐璐等，2009)，九香蟲Aspongopuschinensis(Dallas,1851)即是其中一種(張笠等，2011)。九香蟲始載于《本草綱目》，具有溫中助陽、理氣止痛的功效，是具有較高藥食兩用價值的昆蟲(蔡仁蓮等，2016)?，F代醫學證明其可用于治療肝癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌等(徐波等，2007；范欽等，2011；檀軍等，2013；楊佳琪等，2017；Tanetal.,2019)，也有抗菌和抗氧化等功效(中華本草編委會，1999；高穎暉等，2015)。

研究表明，九香蟲血淋巴具有抑制乳腺癌和胃癌細胞增殖的作用(檀軍等，2013；楊佳琪等，2017)，但九香蟲血淋巴提取工藝較復雜，穩定性較差。九香蟲在臨床上的用藥形式主要為水煎液(劉慶芳，2002)，其制備工藝簡單，經過高溫煎煮，藥物穩定性較高，通過煎煮的方式可使藥物活性成分充分釋放和溶解于湯劑中。然而，高溫煎煮又可導致部分蛋白變性、物質降解等，影響藥效，哪些物質可能發揮主要的抗癌功效等仍然未知。因而本研究通過高溫煎煮九香蟲粉末，制備九香蟲水煎液，檢測其對乳腺癌細胞體外增殖的影響，分析九香蟲水煎液主要成分，并討論分析其主要成分與其主要功效之間的關系，為九香蟲深層次開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

九香蟲(購自貴州省凱里市，置于恒溫干燥箱烘干備用)，人乳腺癌細胞系MDA-MB-453及小鼠乳腺癌細胞系4T1購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑耗材

L-15培養基(武漢博士德生物工程有限公司)，RPMI-1640培養基(美國賽默飛公司)，胎牛血清(杭州四季青)，甲醇(德國CNW Technologies公司)，L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技公司)，0.22 μm針管式過濾器(美國密理博公司)，色譜柱(美國安捷倫公司)。

1.3 實驗儀器

202型電熱恒溫干燥箱(北京永光明醫療儀器廠)，超低溫冰箱(美國賽默飛公司)，Heraeus Fresco17離心機(美國賽默飛公司)，倒置相差顯微鏡(廈門麥克奧迪有限公司)，7890A氣相色譜儀(美國安捷倫公司)，PEGASUS HT質譜儀(美國力可公司)，PS-60AL超聲儀(深圳雷德邦電子有限公司)，LNG-T98真空干燥儀(太倉華美生化儀器廠)，酶聯免疫檢測儀(美國賽默飛公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1樣品制備

九香蟲活蟲以純水清洗兩遍，濾紙吸干蟲體表面水分，置于電熱恒溫干燥箱中80℃烘烤4 h后研磨成粉末，稱取20 g蟲粉，加入80 mL純水，室溫浸泡30 min后于砂鍋中煎煮40 min，最后小火濃縮成濃度為0.5 g/mL的九香蟲水煎液。將九香蟲水煎液以6 000× g離心10 min，吸取上清液并用0.22 μm濾頭過濾除菌，-20℃保存備用。

取200 μL九香蟲水煎液于1.5 mL離心管中，加入800 μL甲醇，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸(1 mg/mL溶于純水中)作為內標，渦旋30 s。于-20℃條件靜置10 min，冰水浴條件下超聲5 min，以12 000× g離心15 min，小心吸取上清液 400 μL，在真空干燥儀中干燥。向干燥后的物質加入甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL)，輕輕混勻后，放入烘箱中80℃孵育30 min。向每個樣品中加入BSTFA(含有1%TMCS，v/v)，將混合物70℃孵育1.5 h，隨機上機檢測。

1.4.2人乳腺癌細胞MDA-MB-453細胞及小鼠乳腺癌細胞4T1培養

人乳腺癌MDA-MB-453使用含10%胎牛血清(FBS)，1%青鏈霉素混合液的L-15培養基，置于37℃，空氣相培養箱中培養。小鼠乳腺癌4T1細胞使用含10%FBS，1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養基，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.4.3形態學觀察法及MTT法檢測九香蟲水煎液對乳腺癌細胞增殖的抑制作用

使用0.25%胰酶消化處于對數生長期的MDA-MB-453、4T1細胞，用細胞計數儀測定細胞密度，調整細胞密度為1×105個/mL，分別接種于96孔培養板中，每孔100 μL。實驗設置實驗組、對照組(無藥物組)及空白組(無細胞組)。用對應培養基將九香蟲水煎液稀釋成生藥濃度梯度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，并用0.22 μm濾頭過濾除菌。24 h后，棄舊培養液，加入上述濃度梯度的水煎液，每個濃度設5個重復。水煎液作用24 h后，利用倒置相差顯微鏡拍攝細胞形態圖。48 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續放入細胞培養箱培養4 h后，吸去上清液，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于恒溫搖床37℃震蕩10 min以徹底溶解紫色結晶。使用酶標儀在570 nm波長條件檢測吸光度(OD)值。每組實驗重復3次。計算細胞增殖率，增殖率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100，并用SPSS 17.0分別計算九香蟲水煎液對兩種細胞的半數抑制濃度(IC50)。

1.4.4細胞劃痕法觀察九香蟲水煎液對小鼠乳腺癌細胞4T1細胞遷移的影響

取對數生長期的4T1細胞消化并接種于24孔板(細胞密度為4×104個/孔)，置于培養箱中培養。待細胞生長90%融合時，用200 μL吸頭沿每個孔的中軸劃痕，劃痕后用無菌PBS洗滌3次。用RPMI-1640培養液稀釋九香蟲水煎液，加入水煎液濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，每個濃度3個復孔。分別在0 h和24 h用倒置相差顯微鏡拍照，觀察各組細胞遷移情況，每組實驗重復3次。采用Image J及SPSS 17.0軟件對實驗結果進行統計分析。細胞遷移率(%)=(0 h 劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度×100。

1.4.5GC-MS測定九香蟲水煎液主要成分

氣相色譜條件：采用DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣，前進樣口流速3 mL/min；柱流速為1 mL/min；進樣量為1 μL。初始溫度50℃，持續1 min，然后以10℃/min的速率上升到310℃，保持8 min；質譜條件：前進樣口、傳輸線和離子源溫度是分別是280、280和250℃；離子源為EI；電子能量70 eV；質譜數據在全掃描模式下獲得，質量掃描范圍m/z為50～500。

1.5 數據處理

實驗數據應用統計軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析，所有數據使用x±s表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 水煎液對乳腺癌細胞增殖抑制的作用

不同濃度九香蟲水煎液作用于乳腺癌MDA-MB-453細胞24 h后，通過細胞形態觀察和MTT實驗檢測九香蟲水煎液對MDA-MB-453細胞增殖的抑制作用。MDA-MB-453細胞形態圖(圖1)顯示，0.04～0.10 g/mL濃度組細胞皺縮，體積變小，細胞貼壁能力降低，漂浮細胞較多，對照組和0.02 g/mL濃度組細胞呈飽滿的圓形，貼壁細胞數量較多，細胞輪廓清晰。

圖1 九香蟲水煎液作用24 h對MDA-MB-453細胞形態的影響Fig.1 Effects of Aspongopus chinensis decoction on the morphology of MDA-MB-453 cells for 24 h注：A-F分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL，200×。Note:A to F reflects 0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 g/mL,200×.

MTT檢測結果顯示，九香蟲水煎液可顯著抑制MDA-MB-453及4T1細胞的生長(P<0.05)。結果表明九香蟲水煎液具有抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-453、小鼠乳腺癌細胞4T1增殖的作用，且呈濃度依賴性，九香蟲水煎液作用于MDA-MB-453、4T1細胞的IC50濃度分別為0.034、0.101 g/mL。

圖2 九香蟲水煎液作用48 h對MDA-MB-453細胞增殖的影響(P<0.05)Fig.2 Effect of Aspongopus chinensis decoction on the proliferation of MDA-MB-453 cells for 48 h(P <0.05)

2.2 九香蟲水煎液對4T1細胞遷移的影響

4T1劃痕實驗結果顯示，對照組4T1細胞遷移率為42.67%±0.88%，濃度為0.02、0.04 g/mL水煎液作用于4T1細胞24 h后遷移率分別為18.33%±4.91%和8.67%±2.85%，加樣濃度為0.06、0.08、0.10 g/mL水煎液作用于4T1細胞24 h后大量細胞漂浮，呈彌散狀，無法測得遷移率。對照組遷移距離顯著大于實驗組(P<0.05)，表明九香蟲水煎液可顯著抑制4T1細胞的遷移能力。

圖3 九香蟲水煎液作用48 h對4T1細胞增殖的影響(P <0.05)Fig.3 Effect of Aspongopus chinensis decoction on the proliferation of 4T1 cells for 48 h(P <0.05)

圖4 九香蟲水煎液作用0 h和24 h對4T1細胞遷移影響的形態圖(40×)Fig.4 Morphological diagram of Aspongopus chinensis decoction on migration of 4T1 cells at 0 h and 24 h (40×)

圖5 九香蟲水煎液作用24 h對4T1細胞遷移的影響(P<0.05)Fig.5 Effect of the Aspongopus chinensis decoction on the migration of 4T1 cells at 0 h and 24 h (P<0.05)

2.3 GC-MS測定九香蟲水煎液主要成分

使用ChromaTOF軟件對質譜數據進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分等分析(Kindetal.,2009)。根據離子流色譜圖(圖6)，使用PubChem和KEGG數據庫，包括質譜匹配及保留時間指數匹配，對物質進行定性分析，共分析得出455種物質。根據峰面積歸一化法得出各成分相對含量。根據數據庫匹配相似性≥800，篩選相對含量較高的20種化合物(表1)。其中，3,4-二羥基苯甲酸(0.88%)、尿苷(0.77%)、反丁烯二酸(0.72%)、腺苷(0.61%)、棕櫚酸(0.61%)等物質可能與其能夠抑制乳腺癌細胞增殖有關。

表1 九香蟲水煎液主要化合物成分Table 1 Main compound components of Aspongopus chinensis decoction

圖6 九香蟲水煎液總離子流量(TIC)圖Fig.6 Total ion flow diagram of Aspongopus chinensis decoction

3 結論與討論

3.1 九香蟲水煎液含有抗菌、抗氧化、鎮痛、助陽等活性成分

九香蟲水煎液GC-MS分析結果顯示，其中含量較多的物質有反丁烯二酸、鳥氨酸、腐胺、瓜氨酸、3,4-二羥基苯甲酸、尿苷、腺苷、棕櫚酸等。反丁烯二酸具有鎮痛及抗菌的作用(吳素香等，2012；董璦榕等，2019)，鳥氨酸與瓜氨酸在體內可轉化為精氨酸，精氨酸、腐胺具有提高精子活性的作用(Moralesetal.,2003)，這幾種物質的作用與《本草綱目》所記載的九香蟲“理氣止痛，溫中助陽”之功效相符。3,4-二羥基苯甲酸廣泛存在于天然藥物中，具有抗菌、抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤的作用(Yinetal.,2009;Gutiérrez-Larraínzaretal.,2012;Palafox-Carlosetal.,2012;Deletal.,2014)，其抗菌和抗氧化的作用與中華本草編委會(1999)和高穎暉等(2015)結論一致。

3.2 九香蟲水煎液可抑制乳腺癌細胞體外增殖

本實驗研究結果顯示，九香蟲水煎液對乳腺癌細胞體外增殖與遷移具有顯著的抑制作用(如圖1～圖5)，結合GC-MS分析結果，在九香蟲水煎液中檢測到了反丁烯二酸、3,4-二羥基苯甲酸、腺苷、尿苷、棕櫚酸(如表1)。反丁烯二酸、3,4-二羥基苯甲酸具有抗腫瘤作用(Yinetal.,2009;吳素香等，2012)，腺苷是抗腫瘤核苷類的前體(劉洋等，2012)，尿苷可以調節乳腺癌細胞的分化、增殖與凋亡(Mujoomdaretal.,2004)；棕櫚酸可抑制肝癌細胞增殖與促進其凋亡(Nagataetal.,2015)。上述物質均可能與九香蟲水煎液能夠抑制乳腺癌細胞增殖有關。

九香蟲經過高溫煎煮仍然具有抑制乳腺癌細胞增殖的活性，通過GC-MS檢測，九香蟲水煎液主要成分中具有抗癌活性的成分較多，便于探究其藥理藥效和篩選抗癌活性成分。但九香蟲水煎液中具體是何種物質起主要的抗腫瘤作用及其抗腫瘤的機制尚需進一步實驗研究。本研究采用的4T1細胞系有很強的遠處轉移能力，可用于構建乳腺移植瘤動物模型，該模型的細胞生長和遠處轉移與人類乳腺癌IV期十分相似，已被成功運用到了惡性腫瘤治療藥物的研究中(Yangetal.,2012)，九香蟲水煎液可顯著抑制該細胞的增殖與遷移，可為后期探究九香蟲水煎液對小鼠乳腺癌的體內抑制作用提供參考。