基于測序技術探究卡介菌生物制劑核酸物質基礎

周云喜　胡亞磊　楊勝梅　謝安　趙李劍　黃勝　童春義

〔摘要〕 目的 明確免疫調節劑卡介菌多糖核酸注射液中起免疫增強作用的核酸物質基礎。方法 （1）核酸提?。涸噭┖蟹ǚ蛛x提取卡介菌及卡介菌多糖核酸注射液的核酸部分;（2）測序：采用第三代測序技術和第二代宏測序技術分別對卡介菌基因組和注射液核酸片段序列進行測序，獲得核酸序列;（3）數據分析：統計分析核酸序列中免疫功能的含胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine-phosphoric acid-guanine，CpG）的典型CpG基序數量及分布情況;（4）免疫活性分析：采用酶聯免疫法分析提取核酸刺激細胞釋放免疫因子TNF-α效果。結果 注射液核酸片段中平均每拷貝含有4 000個典型CpG基序，占總基因組的0.5%;富含CpG基序核酸片段刺激細胞釋放TNF-α濃度顯著強于無CpG基序核酸片段（P<0.01），顯示了較強的免疫調節作用。結論 卡介菌多糖核酸注射液核酸物質中富含CpG基序而表現較強的免疫活性，為進一步開發新型免疫調節制劑提供理論基礎。

〔關鍵詞〕 卡介菌;CpG;生物信息學;測序;物質基礎

〔中圖分類號〕R927.11? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.04.008

Exploration of Nucleic Acid Material Basis of BCG Biological Preparation Based on

Sequencing Technology

ZHOU Yunxi1， HU Yalei2，3， YANG Shengmei1， XIE An2， ZHAO Lijian3*， HUANG Sheng2， TONG Chunyi2，3

（1. Hunan Siqi Biopharmaceutical Co.， Ltd.， Changsha， Hunan 410205， China; 2. Jiuzhitang Co.， Ltd.， Changsha， Hunan 410021， China; 3. College of Biology， Hunan University， Changsha， Hunan 410082， China）

〔Abstract〕 Objective To clarify the nucleic acid material basis of immunomodulator BCG polysaccharide nucleic acid injection for immune enhancement. Methods（1） Nucleic acid extraction： the nucleic acid part of BCG and BCG polysaccharide nucleic acid injection were isolated and extractedby kit method; （2） Sequencing： the third-generation sequencing technology and second-generation macro-sequencing technology were used respectively to sequence the BCG genome and the injection nucleic acid fragment sequences to obtain the nucleic acid sequence; （3） Data analysis： statistical analysis was performed for the typical cytosine-phosphoric acid-guanine （CpG） motif quantity and distribution of CpG containing immune function in nucleic acid sequence; （4） Immunoactivity analysis： Enzyme linked immunoassay was used to analyze the effect of extracted nucleic acid to stimulate cells to release immune factor TNF-α. Results There were about 4000 typical CpG motifs in each copy on average in injection nucleic acid fragments， accounting for 0.5% of the total gene group. Nucleic acid fragments rich in CpG motifs stimulate cells to release TNF-α at a concentration that is significantly stronger than nucleic acid fragments without CpG motifs， showing a stronger immunomodulatory effect. Conclusion The nucleic acid fractions of BCG polysaccharide nucleic acid injection are rich in CpG motif and show strong immune activity， which provides theoretical basis for further development of new immunomodulatory agents.

〔Keywords〕 BCG; cytosine-phosphoric acid-guanine; bioinformatics; sequencing; substances

卡介菌多糖核酸注射液是在卡介苗素基礎上，通過改進工藝生產得到的一種新型非特異性免疫調節劑，主要由核酸及多糖等多種免疫活性物質組成，解決了其它免疫調節劑大分子蛋白清除不徹底等問題，更易于吸收，減少了過敏反應，副作用更小[1]。20世紀 70年代我國開始對卡介菌多糖核酸提取物進行免疫活性的研究，80年代末將其用于臨床，現在相關的注射液產品已經暢銷國內外30年，是免疫調節劑產品中的明星產品?？ń榫嗵呛怂崮茈p向調節機體細胞免疫和體液免疫功能， 具有抗感染、抗變態反應、抗腫瘤等作用[2-3]。除廣泛應用于慢性支氣管炎、哮喘和反復呼吸道感染的防治外，在腫瘤免疫治療等領域的應用也取得了一些新的進展[4-5]。

卡介菌多糖核酸產品的免疫調節作用得到眾多臨床醫生的病例驗證[6-7]，然而，產品作用機制未得到合理的、系統的解釋。針對其中的核酸物質，本文通過調研文獻，發現一類核酸結構，即含未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosine-phosphoric acid-guanine，CpG）二核苷酸的核酸片段與卡介菌多糖核酸產品適應證——超敏類疾病密切相關[8-10]。CpG核酸片段在細菌和病毒基因組含量是人體的20倍，可顯著引起人體做出免疫應答，刺激釋放大量免疫細胞和免疫因子。近年研究表明CpG主要是通過識別和結合人體的Toll受體TLR9[11-12]，激活DC等多種免疫活性細胞，刺激多種免疫活性細胞分泌免疫活性分子（趨化因子、黏附分子和共刺激分子）而發揮其免疫作用。因此，卡介菌多糖核酸產品的免疫作用可能與該類核酸的免疫效應有關。本文針對核酸物質的研究特點，應用第三代測序技術進行全基因組快速測定和第二代宏測序技術對卡介菌注射液核酸片段進行測序，再利用生物信息學技術進行分析探討，結合文獻報道，分析具有免疫活性的CpG結構在基因組和產品中的存在情況，以闡述產品核酸物質基礎，為進一步開發相關產品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1? 實驗材料與試劑

卡介菌菌體以及卡介菌多糖核酸制劑[注射制劑，批號分別為20170601（A），20170642（B），20170661（C），20170682（D），20170691（E）和20180110（a）]由湖南斯奇生物制藥有限公司提供;RAW264.7細胞購于中南大學細胞庫;Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技有限公司;小鼠TNF-α ELISA試劑盒：欣博盛生物科技有限公司;PCR引物：生工生物工程（上海）股份有限公司;2×Power Taq PCR MasterMix：北京百泰克生物技術有限公司;溶菌酶：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2? 主要儀器

MiSeq二代測序儀（美國illumina公司）;PacBio Sequel三代測序儀（美國PacBio公司）;細胞培養箱（美國Eppendorf公司）;YP1002N型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）;THD-0506型恒溫水槽（寧波天恒儀器廠）;5418R/5702R型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;NanoDrop2000型超微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）;Tanon3500型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）等。

1.3? 樣品核酸提取與純化

核酸提取參照試劑盒說明進行。取注射液樣品溶液加BA緩沖液混合均勻，轉移至核酸純化柱高速離心，棄去接液管中液體，然后向核酸純化柱加入G Binding Buffer后高速離心，棄去接液管中液體，之后向核酸純化柱加入Wash Buffer后高速離心，棄去接液管中液體，再次將核酸純化柱高速離心，并將純化柱轉移至新的1.5 mL離心管，最后向純化柱中加Elution Buffer，室溫溫育2 min，于10 000×g離心2 min并棄去純化柱，1.5 mL離心管中液體即為純化核酸得到的DNA樣品。

1.4? 卡介菌基因組和注射液核酸片段測序

1.4.1? 第三代測序技術對卡介菌基因組測序? 將從卡介菌菌體提取的全基因組核酸進行電泳檢測，合格后上第三代測序儀測序，獲得測序原始數據。接著基于測序數據進行基因組的從頭組裝，首先使用Falcon軟件進行原始數據的自我矯正及基因組初步組裝，基于Overlap-Layout-Consensus算法初步組裝得到一致性序列，之后采用GenomicConsensus軟件基于其中的Arrow算法以原始數據為輔助再次對一致性序列進行校正，再使用Sprai程序矯正過的原始序列作為輔助數據將組裝出來的一致性序列進行Circulator環化處理[13-14]，得到最終的基因組序列數據。

1.4.2? 第二代宏測序技術對注射液核酸片段測序? 將注射液分離提取的DNA進行電泳檢測，合格后進行測序建庫。檢測合格的DNA樣品先經過 Covaris 隨機打斷成350～500 bp的片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit試劑盒進行建庫，DNA片段經過末端修復、加poly A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟，最終完成文庫構建。文庫檢驗合格后利用測序儀進行雙端測序，獲得所有片段的核酸序列信息。測序下機獲得原始測序數據后進入生物信息分析，主要通過對測序錯誤率、數據量、比對率、覆蓋度等進行統計，評估建庫測序是否達到了標準[15-17]，符合標準則獲得注射液核酸片段的測序數據。

1.5? 測序數據分析與統計

將獲得的基因序列數據轉化為excel 格式，應用MATLAB軟件分析，撰寫分析函數程序，提取和尋找數據中CpG和CpG基序的位置及出現頻次，構建頻次曲線及位置-頻次曲線。

1.6? 免疫因子TNF-α檢測實驗

首先將培養瓶中的巨噬細胞RAW264.7細胞800×g離心5 min，棄上清，加新鮮培養基重懸細胞，計數并調整細胞濃度為1×106/mL，之后將細胞接種于24孔培養板內，然后置37 ℃、5%CO2、95%濕度的培養箱內培養。將細胞分以下幾組：A組代表從注射液中提取總核酸刺激細胞組;CpG組代表以注射液核酸為模板，PCR擴增得到富含CpG序列的核酸片段刺激細胞組;No-CpG組代表以注射液核酸為模板，PCR擴增得到不含CpG序列的核酸片段刺激細胞組;No-primer組代表擴增時未加引物的PCR體系（為CpG擴增的陰性對照）刺激細胞組;control：未做任何處理空白組。不同細胞組分別加入相同體積的核酸樣品，然后將24孔板置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養箱內培養12 h后，1 000×g離心20 min，取上清進行檢測。免疫因子TNF-α檢測實驗參照小鼠TNF-α ELISA試劑盒說明書進行。提前將小鼠TNF-α ELISA試劑盒從4 ℃冰箱取出以平衡至室溫，設置空白孔加標準品和標本通用稀釋液以減除顯色液的吸光度空白，其余孔中加不同濃度TNF-α標準品以及上清樣品。封膠板紙封住反應孔孵育，洗板之后，空白孔加入生物素化抗體稀釋液，其余孔加生物素化抗體工作液，封板孵育。然后洗板，空白孔加酶結合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液，封板孵育，洗板5次，加入顯色底物避光孵育，之后再加入終止液，混勻之后即刻使用酶標儀測量OD450值。將6批次產品核酸設置為6個平行孔，以計算平均值。以標準品組測定的OD值與空白孔的OD值差值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，樣品測定OD值從標準曲線計算得出TNF-α濃度。

2 結果

2.1? 核酸物質分離純化

2.1.1? 卡介菌菌體全基因組分離提取? 卡介菌菌絲體提取總核酸，電泳結果如圖1a，從圖中可以看出，提取的總核酸條帶清晰，無彌散帶，滿足第三代快速測序。

2.1.2? 注射液核酸物質分離提取? 產品中核酸物質分離純化后，DNA濃度得到進一步富集，使用超微量紫外分光光度計檢測核酸，可發現260/280值也得到顯著提高（從1.6提高到1.9），證明DNA得到純化，蛋白質和多糖雜質降低。電泳結果（圖1b）顯示，經過過濾提純后，不同批次注射液核酸物質條帶亮度增加，表明核酸物質經過離心過濾之后得到顯著富集，但條帶呈現彌散狀態，不適用于第三代測序，而適用于第二代宏測序。故注射液中核酸物質采用第二代宏測序技術進行序列測定。

2.2? 卡介菌基因組測序及注射液核酸宏測序

2.2.1? 卡介菌基因組測序情況? 測序獲得卡介菌完整基因組總長為4 326 779 bp，CpG含量為65.64%，與美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫中卡介菌基因組數據基本一致。

2.2.2? 注射液核酸序列宏測序情況? 核酸序列測序獲得9 311 544個讀數片段，解讀出1 350 520 724 bases，有效解讀率達92%以上，與測序基因組比對發現，覆蓋率達99.22%，說明注射液核酸中99.22%以上來自卡介菌菌體基因組，其他部分為未解讀部分（片段太小未讀出）或來源不明。

2.3? 卡介菌全基因組免疫核酸序列分布和定位分析

2.3.1? 卡介菌基因組中CpG含量及分布分析? 以測序獲得的基因組序列為數據源，分析了基因組中“CpG”出現的頻次、分布圖（見圖2）和分布情況（見表1）。采用400 bp、1 000 bp、1×104 bp和1×105 bp 4種分析間隔分析基因組中CpG的出現頻次，由表1、圖2可知，卡介菌基因組中CpG出現總次數達5.5×105余次（不同分析間隔出現次數差異為分段引起），CpG占總基因組比例達25.5%左右，結果表明卡介菌基因組中富含CpG基元，容易形成大量滿足要求的CpG片段，起到免疫作用。進一步對CpG組在基因組位置分布進行分析，結果顯示CpG在整個基因組中每個區段均有分布，整體較平均，但也有部分區域比例偏高。

2.3.2? 基因組中CpG 基序頻次及分布分析? CpG分析可知卡介菌基因組中含有大量的CpG組，但核酸免疫往往以基序（6～20個核酸堿基組成的功能序列）的形式展現其免疫功能，因此對基序的分析更為重要。以對人特異免疫的4種CpG基序（GACGTT、AACGTT、GTCGTT、TTCGTT）為研究對象，分析了卡介菌基因組中這4種基序的頻次分布情況，結果如圖3，CpG基序在基因組中非常豐富，出現頻次也非常多，4種基序在整個基因組中出現總頻次為3 631次，占整個基因組的0.5%，其中GACGTT和GTCGTT分布出現1 337和1 336次，各占總頻次的37%，是4種基序的主要形式。對基序在基因組中的分布和定位發現，基序在基因組分布較為均勻，也有部分集中的區域。

2.4? 注射液核酸物質與基因組比對及CpG基序分析

2.4.1? 注射液核酸片段序列與基因組比對結果

注射液核酸物質測序共得到9 311 544個大小片段為300～500 bp的測量數，測量得到總堿基數為1 350 520 724 bases，按照卡介菌全基因組含4.32×106 bases，則測量結果可大致為282個拷貝（基因組）的堿基信息結果。

將注射液核酸測序結果與卡介菌基因組測序結果進行比對發現，注射液核酸序列有99.22%以上均能在基因組中找到，而基因組中每個堿基覆蓋1次和10次的概率均為100%，說明注射液中的核酸均來自卡介菌基因組。進一步對基因組各區域堿基的覆蓋次數進行比對，如圖4所示，注射液核酸片段在整個基因組中都出現較高程度的覆蓋和重復，平均重復次數在280次左右，與測序基因組拷貝數282個一致，說明注射液中核酸片段均來源于卡介菌基因組，且各片段的保留程度差異不大。同時從頻次數據可以看出，核酸片段在部分區段（第4.0×105～4.5×105、第3.6×106～3.8×106堿基處）顯著增多，說明這些區段核酸保留地較為豐富，但也有部分區域（第1.4×106～1.45×106堿基處）顯著低于平均值，說明可能有部分核酸的缺失。

2.4.2? 注射液核酸CpG基序保留情況及分布分析? 進一步對注射液核酸中保留的4種CpG基序進行分析，分別以10 000和100 000為間距進行統計分析，如圖5，發現產品核酸中保留了大量的CpG基序，除少數幾個顯著升高的區域，在全基因組中分布也較為平均。從出現頻次可以看出，在282個全基因組數據中保留了1 085 216次，相當于每個卡介菌中保留了3 848次，該數據略高于從全基因組分析得到的3 631次，說明注射液產品中核酸物質活性基序得到一定程度的富集。

進一步對4種CpG基序出現頻次比較，四種基序出現概率分別為GACGTT和GTCGTT各占37%、AACGTT占12%、TTCGTT占14%，與從全基因組分析得到的結果幾乎一致。其中，CpG基序中的GACGTT基序在整個產品核酸中出現頻次最高，且在部分區域表現出顯著升高，最高可達到4 247/1.0×105次堿基，表現出極高的比例。通過對CpG基序分布定位，有望找到富含CpG基序區域，為挖掘CpG免疫核酸制劑提供基礎和數據資源。

2.5? 注射液中核酸物質刺激細胞釋放免疫因子能力初探

為進一步考察卡介菌多糖核酸注射液中核酸物質是否具有免疫刺激活性，以免疫細胞因子TNF-α為檢測細胞因子，研究了提取核酸及以提取核酸為模板克隆得到的含CpG和不含CpG核酸片段刺激巨噬細胞釋放細胞因子的能力。結果如圖6所示，從卡介菌注射液提取核酸物質（A）能夠提高TNF-a釋放，證明了卡介菌注射液中核酸物質能夠增強細胞因子釋放。使用GraphPad Prism 5軟件通過T檢驗分析方法發現，相對于無CpG的核酸片段和克隆緩沖液，克隆得到的富含CpG的核酸片段顯著刺激了細胞因子釋放，證明細胞因子釋放能力主要通過CpG起作用，而通過對卡介菌基因組測序有望篩選得到強免疫刺激能力核酸基序組合，為開發新產品提供依據。

3 結論

卡介菌多糖核酸注射液核酸物質中豐富的CpG基序序列和片段，通過對核酸進行宏測序，獲得了詳細的核酸序列情況，與卡介菌基因組比對發現，產品核酸絕大部分來自卡介菌基因組，基因組覆蓋率達100%。注射液在制備過程中，基因組發生斷裂形成核酸片段，但具有免疫刺激作用的CpG基序在注射液核酸中保留完整，還呈現略有富集增加的趨勢，免疫因子刺激實驗也證明了注射液中豐富的CpG基序保證了產品的免疫刺激能力。實驗結果為闡述產品免疫功能及進一步建立產品質控標準提供了理論基礎。

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〔收稿日期〕2019-11-14

〔基金項目〕湖南省戰略性新興產業科技攻關項目[湘財企指（2015）96號2015GK1024]。

〔作者簡介〕周云喜，男，執業藥師，研究方向：生物制劑研制與生產。

〔通訊作者〕*趙李劍，女，高級實驗師，E-mail：zhaolj6926648@163.com。