槲皮素脂質體制備工藝研究

李雨荷，陳小鈺，黃 妮，徐 熙，賈寧昊，朱文明，王海翔

（1.中國藥科大學工學院，江蘇南京 211198；2.浙江海正藥業股份有限公司，浙江臺州 318000）

槲皮素（Quercetin） 是一種天然的黃酮類化合物，化學名為3,3",4",5,7-五羥基黃酮，廣泛分布于蔬菜、水果、干果、飲料及中草藥之中，具有擴張冠狀動脈、降血脂、抗炎、抗過敏、抗糖尿病并發癥等多種藥理作用[1]，近年已經發現槲皮素對腫瘤具有預防及治療作用[2]。相關研究將槲皮素制成脂質體制劑，以便有效調整藥物的體內分布和釋放特征，起到靶向作用，提高藥物療效[3-4]。然而，由于槲皮素的水溶性非常小、口服吸收不好、生物利用度低、化學穩定性差，極大地限制了其在食品、醫藥和化工等領域的應用。因此，為了改善槲皮素的生物利用度、提高槲皮素的穩定性，試驗將脂質體技術應用于槲皮素中，進行槲皮素脂質體的制備。采用薄膜分散法制備槲皮素脂質體，采用離心法進行包封率測定，并采用響應面法進行處方優化篩選。

1 儀器與試劑

KH-100B型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司產品；RE52CS-1型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；TCL-16G型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品；LC-15C型高效液相色譜儀，日本島津公司產品；ECLIPSE E100型熒光倒置顯微鏡，日本尼康產品。

槲皮素（含量98%），上海阿拉丁生物科技有限公司提供；膽固醇、無水乙醇（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；大豆磷脂，江蘇富盛德生物工程有限公司提供；甲醇（色譜純），上海星可高純溶劑有限公司提供；一水合葡萄糖（分析純），南京化學試劑股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 槲皮素脂質體的制備

稱取適量槲皮素、膽固醇、大豆磷脂于250 mL的茄形瓶中，加入無水乙醇溶解。置于旋轉蒸發儀，設定適合的水浴溫度，無水乙醇完全回收后，茄形瓶內壁形成一層淡黃色均勻薄膜。加入5%的葡萄糖緩沖液50 mL，搖晃至均勻混合，于40℃下水浴加熱旋轉30 min，將溶液轉移至燒杯中，超聲分散5 min，得到淺黃綠色的均一溶液，過0.45 μm微孔濾膜，得到槲皮素脂質體，于4℃下保存[5]。

2.2 脂質體中槲皮素含量測定方法建立

2.2.1 色譜條件

采用月旭Ultimate LP-C18型（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱，流動相：甲醇∶0.4%磷酸=55∶45，檢測波長360 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL。采用外標法。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶液定容，得到1 mg/mL的槲皮素溶液，梯度稀釋為0.1，0.01，0.001，0.000 1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 線性范圍考查

按照2.2.2處理對照品溶液，在2.2.1的色譜條件下，測定槲皮素的峰面積，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X（mg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得到方程為Y=6.076 97×107X-14 293.084 55，R2=0.999 6，線性范圍為0.000 1～0.1 mg/mL。

2.3 建立槲皮素脂質體包封率測定方法

將配置的槲皮素脂質體溶液離心，取上層清液0.2 mL，甲醇定容至10 mL，超聲處理5 min破乳，利用高效液相色譜法檢測藥物。

根據包封率（EE）的計算公式，計算槲皮素脂質體的包封率。

2.4 單因素考查篩選處方

2.4.1 膽固醇和大豆磷脂質量比的考查

固定藥脂比為1∶16，5%的葡萄糖溶液作為水化液，即槲皮素含量10 mg，膽固醇和大豆磷脂的總量為160 mg，水化溫度為40℃。設置膽固醇與大豆磷脂質量比為1∶6，1∶10，1∶12，按2.3方法分別測定脂質體的包封率及載藥量。

不同膽固醇與大豆磷脂質量比處方包封率及載藥量見表1。

結果顯示，其余制備條件不變，隨著大豆磷脂和膽固醇比例的改變，脂質體的包封率和載藥量有明顯變化。當膽固醇與大豆磷脂質量比為1∶6時，制備的脂質體包封率和載藥量最大。

表1 不同膽固醇與大豆磷脂質量比處方包封率及載藥量

2.4.2 藥脂比的考查

固定膽固醇與大豆磷脂質量比為1∶8，5%的葡萄糖溶液作為水化液，槲皮素含量為10 mg，設置藥脂比為1∶16，1∶24，1∶32，1∶40，根據藥脂比及膽固醇與大豆磷脂質量比，按2.3方法分別測定脂質體的包封率及載藥量。

不同藥脂比處方包封率及載藥量見表2。

表2 不同藥脂比處方包封率及載藥量

結果顯示，其余制備條件不變，隨著藥脂比的改變，脂質體的包封率和載藥量有明顯變化。隨著藥脂比的增加，包封率不斷增大，但是載藥量隨之降低。

2.4.3 水化溫度的考查

固定膽固醇與大豆磷脂質量比為1∶8，藥脂比為1∶16，5%的葡萄糖溶液作為水化液，即槲皮素10 mg，膽固醇17.78 mg，大豆磷脂142.22 mg，改變水化溫度分別為30，40，50℃，按2.3方法分別測定脂質體的包封率及載藥量。

不同水化溫度包封率及載藥量見表3。

表2 不同藥脂比處方包封率及載藥量

結果顯示，隨著水化溫度改變，在相同制備條件下，不同水化溫度下脂質體的包封率和載藥量有明顯變化，當水化溫度為50℃時，制備的脂質體的包封率和載藥量最大。2.4.4 水化液的考查

固定膽固醇與大豆磷脂質量比為1∶8，藥脂比為1∶16，水化溫度為40℃，即槲皮素10 mg，膽固醇17.78 mg，大豆磷脂142.22 mg，改變水化液分別為5%的葡萄糖溶液、生理鹽水、pH值7.4的PBS、pH值6.34的PBS。

除了5%的葡萄糖溶液外，其余3種水化液水化后得到的溶液均產生較多的沉淀和泡沫，不考慮采用。

2.5 響應曲面法優化處方

通過單因素考查，確定主要影響制備的因素為藥脂比（A）、膽固醇與大豆磷脂質量比（B）、水化溫度（C），以槲皮素脂質體的包封率及載藥量為參考指標，每個因素設計3個水平，進行響應曲面試驗。

因素與水平設計見表4。

表4 因素與水平設計

以包封率與載藥量權重各50%進行綜合評分，綜合評分的公式為R=50%A+50%B（A為包封率，B為載藥量）。用Design Expert軟件進行數據處理，結果顯示，R與A，B，C呈顯著線性關系（p＜0.01）。R=42.83+3.87×A+3.45×B+1.33×C。

單因素影響見圖1，響應曲面法試驗結果見表5。

圖1 單因素影響

表5 響應曲面法試驗結果

可知槲皮素脂質體制備工藝中影響包封率和載藥量的主次因素順序為A＞B＞C，即藥脂比的影響最大，膽固醇與大豆磷脂質量比次之，水化溫度影響最小。

以綜合評分為指標，最佳處方工藝為A0B1C1，為表5中的第6組試驗。即藥脂比為1∶24，膽固醇與大豆磷脂質量比為1∶8，水化溫度50℃，為槲皮素脂質體制備的最佳工藝。

2.6 槲皮素脂質體的形態觀察

按照上述最佳處方制備3批槲皮素脂質體，測定其包封率和載藥量無顯著差異，制備工藝重現性良好。采用熒光倒置顯微鏡觀察其形態。

槲皮素脂質體分布圖見圖2。

圖2 槲皮素脂質體分布圖

3 結論

制備脂質體過程中，大豆磷脂和膽固醇作為膜的流動性調節劑，其比例的變化對膜的形成有重要影響；成膜后加入水化液在一定溫度下可形成脂質體。因此，單因素試驗考查了大豆磷脂和膽固醇比例、藥脂比、水化溶液、水化溫度。結果表明，除了水化溶液由于水化后結果十分明顯，不進行進一步研究，其余3項均將在后期進一步優化。

試驗優化了槲皮素脂質體的制備工藝，通過單因素試驗和響應曲面法得到了槲皮素脂質體的最優處方為膽固醇與大豆磷脂質量比1∶8，藥脂比1∶24，水化溫度50℃，在此條件下制備的槲皮素脂質體的包封率為109.06%，載藥量為4.54%。