有機溶劑輔助酶解法提取鮑魚內臟魚油的工藝研究

張 帆，陳虹玲，陳錦權，方 婷，潘潔茹

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.福州市疾病預防控制中心，福建福州 350002）

0 引言

鮑魚作為中國傳統名貴食材，位居四大海味之首。自古以來，鮑魚就有海味珍品之冠的美譽，有“一口鮑魚一口金”的說法。鮑魚是軟體動物物種之一，屬于軟體動物門、腹足綱、原始腹足目、鮑科、鮑屬[1]。鮑魚作為當今國內外市場上具有較高的經濟價值的海產品之一，是源于其良好的肉質口感和優質的營養價值，被視為海味八珍之首，歷年來一直獲得大家的好評。近年來，世界鮑魚產業發展迅速，據統計，2017年全球鮑魚養殖總產量約為17×104t[2-3]，中國的養殖產量約占全球87%，同時福建地區產量占全國80%以上。隨著養殖業和加工業規模的不斷擴大，在加工過程中產生了大量廢棄物，其中占鮑魚總質量的15%～25%的內臟等副產物或被直接丟棄或被加工成動物飼料，不僅降低了鮑魚的利用價值而且對環境造成了一定的污染[4]。通過研究發現，鮑魚內臟中含有豐富的蛋白質、多糖、?；撬岷投嗖伙柡椭舅岬壬锘钚猿煞諿5]。如果能對這些副產物進行再加工利用，開發成高價值的產品，對保護環境及資源再利用有著重要的意義。

目前，國內外已有很多專家學者開始對鮑魚內臟進行回收研究利用，研究鮑魚內臟作為生物活性物質的來源和開發功能性保健食品，如抗氧化肽，抗炎肽和酶解抗血栓保健品[6-8]，提取了鮑魚內臟多糖并研究了其抗瘤作用和體外抗氧化活性[9-12]。但鮑魚內臟魚油的研究還鮮有人涉及。

鮑魚內臟中富含脂質，人體不能合成的必需氨基酸EPA和DHA含量豐富，EPA（二十碳五烯酸Eicosapentaeonic Acid） 和 DHA（二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid） 屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFAs）[12]。研究表明，EPA可以降低血脂、膽固醇和軟化血管，在預防心腦血管疾病方面也有著突出的作用，DHA是人腦發育的重要組成物質，在改善腦力勞動者的腦記憶和營養補充中有重要作用[13]，如果可以把資源豐富的鮑魚內臟魚油應用到食品、藥品及保健品等領域，將有廣闊的市場前景。

目前，魚油提取的方法有很多，比較常見的有壓榨法、蒸煮法、有機溶劑法、淡堿水解法、酶解法、超臨界流體萃取法，其中壓榨法的不足之處在于提取率低，因此在魚油提取中很少采用[14]。蒸煮法提取時高溫提取易導致魚油中的營養物質遭到破壞，導致提取的魚油品質較差[15]。淡堿水解法由于廢液中鈉鹽含量高不利于環境保護。利用氨水和銨鹽替代氫氧化鈉和氯化鈉的氨法具有廢液回收再利用生產肥料的優點，但氨水的強揮發性限制了其大規模的應用[16]。超臨界流體萃取法生產成本高，無法應用到產業化生產中[17-18]，酶解法通過利用酶的特異水解特性，篩選適宜的蛋白酶水解物料中蛋白質和脂肪的結合位點，使油脂釋放出來。此方法的提取條件相對寬松溫和，無污染，提取率高，很好地提高了資源的利用率。同時，還可以回收利用蛋白酶水解液中的多肽和氨基酸等功能物質[19-21]。為了進一步提高酶解法對魚油的提取率，將有機溶劑法和酶解法結合在一起使用，旨在為水產加工副產物的活性成分提取提供理論依據。以正己烷-異丙醇（3∶2） 作提取劑輔助酶解法提取鮑魚內臟魚油，探究提取鮑魚內臟魚油的最佳工藝，為鮑魚副產物的綜合開發利用提供基礎數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內臟，詔安海聯食品有限公司提供；胃蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，丹麥諾維信公司提供；正己烷（分析純）、異丙醇（分析純）等，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

DJ1-0.12型小型單道打漿機，江蘇科威機械有限公司產品；JMS-80型膠體磨，溫州市互豐機械有限公司產品；DZF6050型真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；THZ-C型恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠產品；RE-52AA型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品；DD5型臺式低速離心機，長沙英泰儀器有限公司產品；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；CP214型電子天平，奧豪斯儀器（常州） 有限公司產品；FREEN-Q1-10T型純水機，南京易普易達科技發展有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

取出存放在-20℃下保存的鮑魚內臟，加入適量清水解凍清洗，待內臟解凍完畢后立即將其胃部剪去，去除胃內鮑魚攝入的海藻等干擾物和胃酸對后續魚油提取的影響，然后用打漿機絞碎，最后經膠體磨均質后備用。

1.3.2 鮑魚內臟魚油提取工藝

將預處理后的鮑魚內臟按一定的比例與蒸餾水混勻，添加緩沖溶液調節pH值（利用一定濃度的HCl或NaOH溶液調節pH值），加入蛋白酶進行酶解，酶解結束后于沸水浴中滅酶15 min，再加入90 mL的體積比為3∶2的正己烷-異丙醇作萃取劑，然后將其置于振蕩頻率為250 r/min下的恒溫振蕩器中振蕩萃取30 min。萃取結束后靜置分層，取其上層清液，減壓干燥除去萃取劑，放入80℃的真空干燥箱中，將料液干燥至恒質量，得到鮑魚內臟魚油。

1.3.3 魚油提取率的計算

1.3.4 最適酶的選擇

以鮑魚內臟魚油提取率為評價指標，根據表1中所示的5種酶的最適酶解pH值、最適酶解溫度、最適酶添加量、最適酶解時間的條件下加入相應的蛋白酶對鮑魚內臟進行酶解，考查下列5種蛋白酶的鮑魚內臟魚油的提取效果，選擇最適酶。

5種酶的最佳酶解條件對照見表1。

表1 5種酶的最佳酶解條件對照

1.3.5 單因素試驗

（1） 料液比。在5個250 mL的錐形瓶中分別放入5 g預處理后的鮑魚內臟并編號。分別按鮑魚內臟∶蒸餾水為1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5的比例加入蒸餾水攪勻。加入緩沖液將pH值調至7.0，之后加入酶添加量為1.5%的木瓜蛋白酶，將其置于55℃水浴中酶解3 h。酶解結束后，將其置入沸水浴中滅酶15 min，再加入90 mL的體積比為3∶2的正己烷-異丙醇作萃取劑，于振蕩頻率250 r/min下振蕩萃取30 min。萃取結束后待其靜置分層，取其上層清液，減壓干燥除去萃取劑，放入80℃的真空干燥箱中將料液干燥至恒質量。計算各組的魚油提取率并確定最合適的料液比。

（2） 酶解溫度。在5個250 mL的錐形瓶中分別放入5 g預處理后的鮑魚內臟并編號。分別按照鮑魚內臟∶蒸餾水為1∶1的比例加入蒸餾水攪勻，加入緩沖液調節pH值至7.0。之后加入酶添加量為1.5%的木瓜蛋白酶，將其置于恒溫水浴鍋中酶解3 h，水浴溫度分別為35，45，55，65，75℃。酶解結束后將其置入沸水浴中滅酶15 min。再加入90 mL的體積比為3∶2的正己烷-異丙醇作萃取劑，然后將其置于振蕩頻率為250 r/min下的恒溫振蕩器中振蕩萃取30 min。萃取結束后待其靜置分層，取其上層清液，減壓干燥除去萃取劑，放入80℃的真空干燥箱中將料液干燥至恒質量。計算各組的魚油的提取率并確定最佳酶解溫度。

（3） 酶解時間。在5個250 mL的錐形瓶中分別放入5 g預處理后的鮑魚內臟并編號。分別按鮑魚內臟∶蒸餾水為1∶1的比例加入蒸餾水攪勻，加入緩沖液將pH值調至7.0。之后加入酶添加量為1.5%的木瓜蛋白酶，將其置于55℃水浴中，各組的酶解時間分別為2，3，4，5，6 h。酶解結束后于沸水浴中滅酶15 min，再加入90 mL的體積比為3∶2的正己烷-異丙醇作萃取劑，然后將其置于振蕩頻率為250 r/min下的恒溫振蕩器中振蕩萃取30 min。萃取結束后待其靜置分層，取其上層清液，減壓干燥除去萃取劑，放入80℃的真空干燥箱中將料液干燥至恒質量。計算各組的魚油提取率并確定最佳酶解時間。

（4） 酶解pH值。在5個250 mL的錐形瓶中分別放入5 g預處理后的鮑魚內臟并編號。分別按鮑魚內臟∶蒸餾水為1∶1的比例加入蒸餾水攪勻。分別加入pH值緩沖液調節各組的pH值，分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，之后加入酶添加量為1.5%的木瓜蛋白酶，將其置于55℃水浴中酶解3 h。酶解結束后于沸水浴中滅酶15 min。再加入90 mL的體積比為3∶2的正己烷-異丙醇作萃取劑，于振蕩頻率250 r/min下振蕩萃取30 min。萃取結束后待其靜置分層，取其上層清液，減壓干燥除去萃取劑，放入80℃的真空干燥箱中將料液干燥至恒質量。計算各組的魚油提取率并確定最佳酶解pH值。

（5）酶添加量。在5個250 mL的錐形瓶中分別放入5 g預處理后的鮑魚內臟并編號。分別按鮑魚內臟∶蒸餾水為1∶1的比例加入蒸餾水攪勻，加入緩沖液將pH值調至7.0。之后加入木瓜蛋白酶，其中的酶添加量分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，將其置于55℃水浴中酶解3 h。酶解結束后于沸水浴滅酶15 min，再加入90 mL的正己烷-異丙醇（3∶2） 作萃取劑，于振蕩頻率為250 r/min下振蕩萃取30 min。萃取結束后待其靜置分層，取其上層清液，減壓干燥除去萃取劑，放入80℃的真空干燥箱中將料液干燥至恒質量。計算各組的魚油提取率并確定最佳酶添加量。

1.3.5 試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，選擇主要的影響因素進行正交試驗設計，選取L9（34）正交表，確定最佳的魚油提取工藝方案。所得的試驗數據采用Microsoft Excel，SPSS16.0軟件進行處理及分析。

2 結果與分析

2.1 最適酶的選擇

按照5種蛋白酶在最適酶解條件下酶解預處理鮑魚內臟后，測定各組蛋白酶酶解后的鮑魚內臟魚油的提取率。

不同蛋白酶對鮑魚內臟的酶解效果見圖1。

由圖1可知，在最適酶解條件下，不同種類的蛋白酶對鮑魚內臟中蛋白質和其他成分的酶解程度不同，從而影響鮑魚內臟油成分的釋放效果，對后續的正己烷-異丙醇萃取鮑魚內臟魚油也產生了影響。其中在木瓜蛋白酶酶解后，從鮑魚內臟中的魚油提取率最高為18.44%；而且物料的pH值也接近中性，故確定木瓜蛋白酶為最佳酶解蛋白酶。

2.2 單因素試驗

圖1 不同蛋白酶對鮑魚內臟的酶解效果

圖3 酶解溫度對鮑魚內臟魚油提取率的影響

2.2.1 料液比對鮑魚內臟魚油提取率的影響

料液比對鮑魚內臟魚油提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當料液比為1∶1比例范圍內時，提高料液比的比例能較大地提升鮑魚內臟魚油的提取率，當料液比為1∶1時提取率達到了最大值，為18.09%。當超過該臨界料液比時，料液比的擴大反而使鮑魚內臟魚油的提取率降低。出現該結果的原因可能是由于在該臨界的料液比條件下，已達到了最大的料液濃度平衡，料液比擴大導致水添加量過多，降低了木瓜蛋白酶的濃度，從而降低酶解的速率，導致魚油提取速率下降，并且木瓜蛋白酶可能會酶解鮑魚內臟中的魚油成分，從而提取的魚油量逐漸減少。隨著料液比的不斷擴大，魚油的提取速率趨于平緩，并且沒有明顯的變化?？赡艿脑蚴钱斶_到一定的料液比時，物料中的蛋白質和其他成分基本已經被水解，使得整個體系到了濃度平衡，所以魚油的提取率基本不變。因此，當料液比為1∶1時，為提取鮑魚內臟魚油的最佳料液比。

2.2.2 酶解溫度對鮑魚內臟魚油提取率的影響

酶解溫度對鮑魚內臟魚油提取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著溫度的升高，鮑魚內臟魚油的提取率呈現先升后降的趨勢。酶解溫度為45℃時，鮑魚內臟魚油的提取率最高，達到18.68%。主要原因是溫度對木瓜蛋白酶的活性有重要影響。隨著溫度的升高，酶的活性逐漸增加，反應速率隨溫度的升高而增加，從而導致鮑魚內臟魚油提取率的增加；但是酶本身是蛋白質，溫度繼續升高會使其本身變性從而失活，酶解能力也隨之下降，影響了油脂的釋放程度，從而使鮑魚內臟魚油的提取率下降。因此，當酶解溫度為45℃時，是提取鮑魚內臟魚油的最佳酶解溫度。

2.2.3 酶解時間對鮑魚內臟魚油提取率的影響

酶解時間對鮑魚內臟魚油提取率的影響見圖4。

由圖4可知，鮑魚內臟魚油的提取率隨時間先增加，然后下降到平坦的趨勢。當酶促水解時間為3 h時，油的提取率達到最大值17.73%?？赡艿脑蚴请S著酶水解時間的增加，木瓜蛋白酶將持續水解鮑魚內臟中的蛋白質和其他物質，使得鮑魚內臟中的油脂成分釋放速度增加，鮑魚內臟魚油提取率隨之增大；但是隨著酶解時間的繼續增加，鮑魚內臟中的油脂成分可能會被木瓜蛋白酶酶解；當酶解時間大于5 h時，酶的酶解能力已達到飽和，物料中的溶質基本被溶劑所提取出來，達到了整個體系的濃度平衡。因此當酶解時間為3 h時，是提取鮑魚內臟魚油的最佳酶解時間。

2.2.4 酶解pH值對鮑魚內臟魚油提取率的影響

酶解pH值對鮑魚內臟魚油提取率的影響見圖5。

由圖5可知，鮑魚內臟魚油隨著pH值的增長呈現出了先增長后下降的趨勢，且當酶解pH值為7時，達到了木瓜蛋白酶最適酶解溫度，同時鮑魚內臟魚油的提取率達到了最大值，為18.91%?？赡艿脑蚴请S著pH值的增加，逐漸達到了木瓜蛋白酶的最適酶解溫度，所以其酶解活力逐漸增強，反應速率也隨之增快，鮑魚內臟魚油的提取率增加；但是當酶解pH值繼續增加，超過了木瓜蛋白酶的最適pH值后，木瓜蛋白酶逐漸因變性而失活，使得鮑魚內臟中蛋白質等物質分離的速度下降，影響了鮑魚內臟魚油的提取。綜上所述，當酶解pH值為7時，是提取鮑魚內臟魚油的最佳pH值。

圖5 酶解pH值對鮑魚內臟魚油提取率的影響

2.2.5 酶添加量對鮑魚內臟魚油提取率的影響

酶添加量對鮑魚內臟魚油提取率的影響見圖6。

圖6 酶添加量對鮑魚內臟魚油提取率的影響

由圖6可知，鮑魚內臟魚油的提取率隨著酶添加量從0.5%到1.5%迅速增加，且當酶添加量達到1.5%時，油脂的提取率達到最大值，為18.86%；但是隨著酶添加量繼續增加，鮑魚內臟魚油的提取率出現顯著的下降趨勢?？赡茉蚴请S著酶添加量的增加，料液中酶濃度增加，蛋白酶會更加充分地酶解鮑魚內臟中的蛋白質和其他成分，有利于油脂成分的釋放，從而使鮑魚內臟魚油提取率增加；但是隨著酶添加量繼續增加，料液的物料濃度太高導致溶液變稠，使得油脂不能很好地與蛋白質等物質分離，且過多的木瓜蛋白酶還會酶解鮑魚內臟中的魚油，反而不利于魚油的提取。綜上所述，當酶添加量為1.5%時，是提取鮑魚內臟魚油的最佳酶添加量。

2.3 正交試驗優化結果與分析

在單因素試驗的結果上，利用正交分析對鮑魚內臟魚油的提取工藝進行優化。單因素試驗結果表明，鮑魚內臟魚油的提取率在料液比和pH值分別達到1∶1和7時，在這兩種影響因子的作用下，油脂的提取率處于相對穩定的水平。因此，選擇酶解溫度，酶添加量和酶解時間作為工藝優化的研究對象，參考指標為鮑魚內臟魚油的提取率。選用L9（34）表進行正交試驗，以確定提取油的最佳工藝條件。

正交試驗因素與水平設計見表2，正交試驗結果及分析見表3，正交試驗方差分析見表4。

表2 正交試驗因素與水平設計

表3 正交試驗結果及分析

表4 正交試驗方差分析

由表3可知，影響鮑魚內臟魚油提取率的因素依次為A＞B＞C，即酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間，最佳方案為A2B2C3。從表4的正交方差分析結果可以看出，酶解溫度的方差值大于F0.01(2,2)，說明其對鮑魚內臟魚油的提取率具有極顯著的效果，酶添加量因素的方差值介于F0.05(2,2)和 F0.01(2,2)之間對鮑魚內臟魚油的提取率有顯著影響（0.01＜p＜0.05），而酶解時間沒有顯著影響 （p＞0.05）。

綜上所述，在料液比1∶1，酶解溫度55℃，酶添加量1.5%，酶解時間4 h，酶解pH值為7時是鮑魚內臟魚油的最佳提取工藝。在此條件下，鮑魚內臟魚油的提取率達到了18.93%，符合第5組的各因素組合。

3 結論

以鮑魚內臟為研究對象，用5種不同的蛋白酶對鮑魚內臟中魚油進行酶解提取，選擇最適的酶，再利用有機溶劑輔助酶解提取，以提高魚油提取率。結果表明，木瓜蛋白酶的提取率最高達到了18.44%，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化得到最佳提取工藝為料液比1∶1，酶解溫度55℃，酶添加量1.5%，酶解時間4 h，pH值7，其油脂的提取率最高為18.93%。在此條件下鮑魚內臟魚油提取率較高，品質較好，研究結果將為鮑魚副產物的綜合利用提供一定的理論支持和指導。