斜紋夜蛾核型多角體病毒的鑒定及室內消除

徐莉,李冬植,陳錫嶺,張少武,周鋒,關祥斌,曹瓊,司賢良,李劍峰,劉潤強

（1.河南科技學院資源與環境學院,河南新鄉453003；2.陜西美邦藥業集團股份有限公司,陜西渭南715500；3.河南省植物保護植物檢疫站,河南鄭州450002；4.河南省農藥檢定站,河南鄭州450002；5.上海滬聯生物藥業（夏邑）股份有限公司,河南商丘476400；6.河南銀田精細化工有限公司,河南原陽453500）

斜紋夜蛾（Spodoptera litura（Fabricius））是一種鱗翅目夜蛾科的農業害蟲,廣泛分布于世界各地,寄主范圍涉及棉花、煙草、大豆以及蔬菜等120 種作物[1],其在幼蟲階段具有暴食性,極易爆發成災.化學農藥仍然是當前防治斜紋夜蛾的主要手段,根據文獻報道,在巴基斯坦、印度和中國的多地,斜紋夜蛾已對多種傳統型和新型殺蟲劑產生了不同程度的抗藥性,包括擬除蟲菊酯類、有機磷、氨基甲酸酯、雙酰胺以及阿維菌素等[2-9].由抗藥性導致的防效下降和用藥量增加,不僅給作物產量造成了嚴重影響,對環境安全也產生了極大的威脅.采用室內飼養技術提供斜紋夜蛾標準試蟲,對于防治斜紋夜蛾農藥品種的篩選、抗藥性研究和綜合防治,以及種質資源利用,均具有十分重要的意義.

斜紋夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SlNPV）是一種有效防治斜紋夜蛾的微生物農藥,已廣泛用于斜紋夜蛾的田間防治,具有害蟲不易產生抗藥性、對環境和非靶標生物安全、對斜紋夜蛾種群具有較高的致病和致弱作用等特點[10].然而室內飼養的斜紋夜蛾種群一旦感染SlNPV,處理不當即可導致整個實驗種群的滅絕,嚴重影響斜紋夜蛾相關研究工作的順利進行.

截至目前,對SlNPV 的基因功能和田間應用研究較多[11-16],而如何解決實驗室條件下試蟲感染SlNPV的問題尚未見報道,本文就實驗室飼養的標準試蟲感染SlNPV 的鑒定以及防治方法進行研究,以期為實驗室斜紋夜蛾標準化飼養提供參考.

1 材料與方法

1.1 試蟲飼養及染毒

2019 年8 月和9 月先后從湖北潛江和浙江紹興采集斜紋夜蛾幼蟲100 余頭,將其轉入養蟲室與長期室內飼養的廣西種群[17]在室內不接觸藥劑的情況下連續飼養,飼養條件為27±1 ℃,相對濕度保持在60%～70%,光照周期（光∶暗）14 h∶10 h.其中潛江種群在養蟲室飼養一代,各階段蟲態均表現正常.而紹興種群的幼蟲在采集當代即出現腹部淡紅色,蟲子向高處爬,倒掛于管口棉花處,稍微碰觸即導致蟲體裂解,流出白色無氣味膿狀物,死亡時間長則蟲體自行腐爛裂解為灰白色液體等癥狀,幼蟲化蛹后出現腹部包裹缺陷（圖1）,不能正常羽化和產卵,未能飼養至下一代.當紹興種群與潛江種群和廣西種群混養時,潛江種群和廣西種群的幼蟲隨即出現上述癥狀,通過文獻查閱,初步推斷此癥狀是感染SlNPV 所致.為了解決此問題,保障室內種群實驗材料的延續,以潛江種群為研究對象,對該病害進行了鑒定和防治方法的探索.

圖1 斜紋夜蛾幼蟲和蛹感染SlNPV 的癥狀Fig 1. The symptoms of S. litura larvae and pupal infected with SlNPV

1.2 病毒粗提

取5 條典型患病死蟲于已滅菌研缽中研碎,放置一段時間使其腐化,細胞降解釋放出病毒顆粒.用無菌蒸餾水將研磨物沖洗至一小燒杯中,取部分懸液置于離心管中,4 000 r/min 離心30 min,棄上清,用適量的無菌蒸餾水懸浮沉淀,800 r/min 離心5 min,取上清轉入另一離心管中,再重復以上離心步驟兩次,得到純化的病毒顆粒.

1.3 病毒的分離鑒定

根據文獻報道合成兩對以SlNPV 的蛻皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖轉移酶（Ecdysteroid UDPglucosyltransferase,egt）為模板的特異性引物egt-F1：5 "-GCCTCGTCGGTCGACTGGAC-3 ", egt -R1：5"-TTCGATAACAATCGGCCTGTACC-3",產物大小380 bp[18]；egt-F2：5"-GCCAAAGATTCATAACCATAG TCGTCATA-3",egt-R2：5"-TTCGGCGTAGGCGGTTGTTTCGTCA-3",產物大小685 bp[19].以1.2 中分離純化的病毒顆粒為模板,分別以egt-F1、egt-R1 和egt-F2、egt-R2 為引物對,使用2×Taq MasterMix（北京天根）進行擴增,用普通瓊脂糖DNA 回收試劑盒（北京天根）回收擴增產物,送上海生工測序.

1.4 SlNPV 的室內消除

以已感染病毒的潛江種群為研究對象,分別按照表1 的兩種方法進行飼養,用調整前的飼養方案進行一代試驗,調整后的飼養方案連續進行兩代試驗,統計幼蟲化蛹率和蛹的羽化率.

表1 斜紋夜蛾各蟲態調整前后的飼養方案對比Tab.1 The rearing methods comparison of S.litura before and after adjustment

2 結果與分析

2.1 SlNPV 鑒定結果

以粗提取的病毒顆粒為模板,以egt-F1、egt-R1 和egt-F2、egt-R2 為引物對,PCR 擴增結果如圖2 所示, 均能得到與預期大小一致且特異性好的條帶, 將擴增條帶的測序結果與egt（GenBank 登錄號：X99073.1）的DNA 序列進行比對,顯示引物對egt-F1 和egt-R1 的擴增結果與該基因序列有100%的同源性（見圖3）,引物對egt-F2 和egt-R2 的擴增結果與該基因序列只有一個堿基差異（見圖4）,證明斜紋夜蛾感染的病毒即為SlNPV.

圖2 病毒粗提物egt 基因的PCR 結果Fig.2 The PCR results of egt from virus extracts

圖3 引物對egt-F1 和egt-R1 的擴增序列與SlNPV egt 基因的同源性比對Fig.3 The blast result of the PCR result of egt-F1 and egt-R1 and SlNPV egt

圖4 引物對egt-F2 和egt-R2 的擴增序列與SlNPV egt 基因的同源性比對Fig.4 The blast result of the PCR result of egt-F2 and egt-R2 and SlNPV egt

2.2 飼養方案調整前后SlNPV 的室內消除效果

染病幼蟲飼養方案調整前及調整后兩代的種群生長情況見表2.

表2 染病斜紋夜蛾幼蟲飼養方案調整前及調整后兩代的種群繁殖情況Tab.2 The reproduction of S. litura larvae infected with SlNPV before and after rearing method adjustment

由表2 可知,飼養方案調整前有81.3%（488 頭）的斜紋夜蛾幼蟲感染SlNPV,且多在5～6 齡出現感病癥狀.雖然有18.67%（112 頭）的幼蟲可以化蛹,但大部分蟲蛹存在腹部包裹不全的缺陷（圖1）,這類蟲蛹不能正常羽化,最終只有4.83%（29 頭）的正常蟲蛹,且羽化率只有68.97%.飼養方案調整后的第一代試蟲,蟲蛹數即得到明顯提高,正常蟲蛹數達到125 頭,化蛹率62.50%,與調整前有明顯的提升,羽化率也提高到96.00%.采用調整后的飼養方案繼續飼養第一代染病幼蟲的后代,即第二代斜紋夜蛾幼蟲,幼蟲的化蛹率和羽化率得到進一步提高,分別達到90.00%和97.78%,飼養方案調整后,指行管中飼養的試蟲很少出現染病癥狀.

3 結論與討論

SlNPV 雖然對田間斜紋夜蛾種群有致病和致弱作用,但其在自然條件下效果不穩定[20],一般需要與其他殺蟲劑復配使用,以達到良好的殺蟲效果.然而在飼養斜紋夜蛾的實驗室,由于環境封閉且溫濕度適宜,SlNPV 極易流行并形成持續性的交叉感染,使病毒迅速在多個種群中傳播,嚴重威脅斜紋夜蛾標準試蟲的飼養,探索一套控制SlNPV 在室內流行的方法對斜紋夜蛾相關科學研究有重要意義.

隨著SlNPV 作為生物農藥的廣泛使用,田間斜紋夜蛾感染SlNPV 存在一定的普遍性.本研究中從紹興采集的斜紋夜蛾種群中攜帶SlNPV,并傳染至健康種群,包括在室內飼養多代的廣西種群和在室內飼養一代的潛江種群.溫榮輝等[18]對采自廣西16 個地區的200 份自然死亡斜紋夜蛾樣本進行檢測,發現其中6 個地區的62 份樣本中可以檢測到SlNPV,表明廣西田間的斜紋夜蛾自然種群中已經存在SlNPV 的流行.因此建議田間采集的斜紋夜蛾幼蟲帶回實驗室后應先放在培養箱等隔離空間內單獨飼養,飼養一代無病毒感染癥狀后再轉入養蟲室飼養,以防止感染室內斜紋夜蛾種群.

NPV 有多種檢測方法,包括光學顯微鏡、DNA 點雜交和PCR 等,PCR 具有靈敏度高、方便快捷的特點, 但是對引物特異性要求高.egt 是SlNPV 中的一個保守基因, 在多種NPV 病毒中均存在,egt-F2 和egt-R2 特異性好,只有當模板是SlNPV 時才能擴增出目的條帶[19],使用兩對特異性引物同時進行擴增,更保證了試驗結果的準確性.我們的試驗進一步證明了引物對egt-F2 和egt-R2 的特異性,可以作為PCR法鑒定SlNPV 的特異性引物.

病毒在蟲體內的傳播方式包括水平傳播和垂直傳播,垂直傳播包括卵內和卵表傳播[20],但目前尚未明確SlNPV 是通過卵表或者卵內進行垂直傳播.本研究通過對子代卵塊和蛹的消毒,以及初孵幼蟲的分裝,在室內環境下除了個別蟲體仍被感染外,基本可以消除SlNPV 在斜紋夜蛾種群中的傳播.但是如果只對卵塊和蛹消毒,仍將幼蟲放于塑料方盒集中飼養（該法飼養方便、效率高）,通過進食和排泄導致水平傳播,幼蟲在生長后期則會有較多個體感染病毒.因此,我們的試驗可以表明SlNPV 主要通過卵表傳播,同時仍有較低概率的卵內傳播.張彥[21]對家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV）的傳播方式進行研究,發現只需雌蛾或雄蛾染毒,子代幼蟲就會出現染毒癥狀,即使對染毒蟲卵嚴格消毒后,仍然可以用PCR 檢測到BmNPV 的存在,表明BmNPV 在家蠶的垂直傳播中也包括卵表和卵內兩種傳播方式. 蔣杰賢等[22]用甜菜夜蛾核型多角體病毒（Spodoptera exigua Nucleopolyhedrovirus,SeNPV）感染4 齡和5 齡甜菜夜蛾幼蟲,研究對子代的影響,發現母體經口感染后可導致子代20%～48%的死亡,即使對卵表消毒,依然可導致子代18.8%的死亡率,也證明了SeNPV 存在卵內和卵表傳播途徑.綜合考慮SlNPV 的傳播規律,制定斜紋夜蛾核型多角體病毒的室內消除方案,既要通過表面消毒阻斷垂直傳播中的卵表傳播,又要嚴格按照單管分裝飼養阻斷小概率的卵內傳播引起的水平交叉感染.