黃腐酸鉀與殼寡糖結合拮抗菌XW5抑制蘋果腐爛病初步探索

張萌欣 薛勝平

摘 要：通過土壤稀釋法篩選出對蘋果腐爛病有拮抗作用的放線菌，采用平板對峙法測定拮抗菌的抑菌活性;測定黃腐酸鉀和殼寡糖單因素對蘋果腐爛病的抑制作用;正交實驗測定放線菌、黃腐酸鉀、殼寡糖復合后對蘋果腐爛病的抑制作用。結果顯示：篩選得到的菌株Z-10為放線菌，對蘋果腐爛病致病菌的抑制效果良好，抑菌率達到50.41%;黃腐酸鉀濃度為0.3%時，抑菌率達到85.88%;殼寡糖濃度為0.1%時，表現出較強的抑菌效果，抑菌率達到61.25%。黃腐酸鉀、殼寡糖、放線菌稀釋菌液濃度分別為0.3%、0.1%、1.25×10-3mg/mL時，對蘋果腐爛病的抑制率達到77.85%。

關鍵詞：蘋果腐爛病;放線菌;黃腐酸鉀;殼寡糖;配方

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200515006

蘋果腐爛病，是黑腐皮殼屬（Valsa ceratosperma，無性型為殼囊孢屬Cytospora）真菌侵染樹體而引起的一種病害，又稱臭皮病、爛皮病[1]?；疾≥^輕的蘋果樹會削弱樹勢，降低蘋果產量，嚴重的病樹會導致枯死，毀園。蘋果腐爛病在我國北部地區發生廣泛，已經成為危害我國蘋果產業的重要病害之一。

目前，防治蘋果腐爛病的方式主要還是化學防治，但是長期使用化學制劑會使病原菌產生一定的抗藥性，環境污染和化學殘留問題也隨之而來。探索生物防治技術已經成為生產上亟待解決的重要課題[2]。微生物防治，是利用有益微生物和微生物代謝產物對病害進行防治，利用2個生物間進行營養和空間的競爭，是一種有效的防治技術。徐路明等人[3]從土壤中分離的放線菌X1菌株能廣譜抑菌，其發酵液能很好地抑制蘋果腐爛病、蘋果輪紋病和黃瓜枯萎病等多種病菌。薛應鈺等人[4]用分離到放線菌菌株ZZ-9的發酵濾液處理蘋果樹腐爛病病菌，病菌菌絲顏色變深，分支增多，末端膨大畸形，出現原生質濃縮，內含物釋放的現象，抑菌效果達到75%。

黃腐酸是腐植酸類物質中分子量較小的一個組分，含活性官能團多，生物活性高，水溶性好，能有效促進植物生長。研究表明，黃腐酸能抑制多種植物病害。馬煥普等人[5]實驗中，在葡萄葉上噴施黃腐酸，降低了白腐病的發病率;許旭旦等人[6]和陳國參[7]的實驗用黃腐酸處理蘋果腐爛病病斑，發現能明顯促進病斑周圍愈傷組織的生長，且不會燒傷活體樹細胞，干邊率下降，從而增強抵抗腐爛病菌侵入和擴展的能力，發病機會減少。

殼寡糖是一種聚合度為2-20的低聚糖，通過殼聚糖降解得到，具有水溶性、廣譜抑菌性，能抑制多種植物病原真菌和細菌的生長。胡健等人[8]用殼寡糖處理馬鈴薯環腐病菌、棉花炭疽病菌、小麥赤霉病菌時，發現其能抑制病原菌生長繁殖及真菌孢子萌發。臧珉等人[9]用殼寡糖處理棉花枯萎病菌和煙草赤星病菌，發現其能抑制病原菌菌絲的生長。

黃腐酸鉀和殼寡糖能有效抑制多種病原真菌生長，但在施用過程中，自然界中微生物總數龐大，對特定植物病害病原菌防治效果難以確定。單獨使用拮抗菌對病原菌進行防治，不能確定該拮抗菌是否會成為優勢種群。本研究旨在將拮抗菌與黃腐酸鉀、殼寡糖組合使用，為拮抗菌提供一個優良環境，可以促進拮抗菌成長為優勢種群，抑制病原菌生長，同時誘導植物抗性，減少病害的發生。

本研究通過篩選出一株對蘋果腐爛病有拮抗作用的放線菌，初步測定了與黃腐酸鉀、殼寡糖結合后對蘋果腐爛病菌的抑制情況，以期為生物防治的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

河北經貿大學海棠樹園患有腐爛病的果樹根際土。

1.2 供試病原菌

蘋果腐爛病病原菌來源河北農業大學植物病害流行與綜合防控研究室。

1.3 供試培養基

拮抗菌的分離及保存用高氏一號培養基，拮抗試驗用高氏一號培養基和PDA培養基，拮抗菌液體培養用MH培養基。

1.4 放線菌的分離純化

用20目篩篩去土壤中顆粒較大的土塊及雜質，取10g土壤樣品，加入90mL無菌水，震蕩10min，制成10-1土壤懸液，無菌條件下依次稀釋得到10-4、10-5、10-6土壤懸液。吸取10-4、10-5、10-6土壤懸液0.1mL到高氏一號平板中，涂布均勻，每個濃度設3個平行;將涂布好的平板靜止幾分鐘，放到28℃培養箱內倒置培養。培養3d后，根據不同菌落形態、氣生菌絲的特點挑選單菌落，再用接種環將單菌落劃線到高氏一號平板上，28℃培養7～14d后檢查。將純化3次后的菌株接種到高氏一號斜面培養基上培養7～14d，于4℃保存。

1.5 放線菌對蘋果腐爛病抑菌活性的測定

采用平板對峙法[10]測定放線菌株對蘋果腐爛病的抑菌活性。將高氏一號培養基和PDA固體培養基融化后按照1∶1的比例倒平板，制成高氏一號、PDA混合平板。無菌打孔器打制菌餅，將放線菌菌餅放在平板邊緣，28℃培養1～2d后再將蘋果腐爛病菌餅放置于平板中央，置于28℃恒溫培養，計算抑菌率。計算公式如下：

抑菌率（100%）=（對照菌落面積-處理菌落面積）/對照菌落面積×100%

1.6 黃腐酸鉀單因素對蘋果腐爛病的抑制作用測定

稱取黃腐酸鉀溶于水配制系列濃度：3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，與PDA培養基混合，配制成所需濃度的帶藥培養基;將蘋果腐爛病菌餅放在平板中央，28℃恒溫培養，待空白對照致病菌長滿平板時計算抑菌率（同上述公式）。

1.7 殼寡糖單因素對蘋果腐爛病的抑制效果測定

稱取殼寡糖溶于水配制成0.4%、0.5%、1%、4%、5%的殼寡糖溶液，與PDA培養基混合，配制成所需濃度的帶藥培養基，中間接種致病菌菌餅，28℃恒溫培養。待空白對照致病菌長滿平板時計算抑菌率（同上述公式）。

1.8 黃腐酸鉀、殼寡糖與放線菌結合對腐爛病的抑制作用 ?將篩選得到的放線菌接種到MH培養基中，180r/min，28℃搖床培養，得到放線菌懸液，將菌懸液中菌絲球稀釋得到0.25mg/mL、0.025mg/mL 2個濃度，制成菌平板最終濃度為1.25×10-2mg/mL、1.25×10-3mg/mL，標記為a、b;根據上述黃腐酸鉀和殼寡糖單因素實驗結果，選擇高低2個不同濃度結合制作平板，在平板中央放上蘋果腐爛病菌餅，判斷不同高低濃度結合在一起對腐爛病抑制作用。設計L4（23）3因素2水平正交實驗（表1）。

2 結果

2.1 放線菌對蘋果腐爛病抑制效果

從土壤中共分離得到12株放線菌菌株，其中5株對蘋果腐爛病表現出拮抗活性，將這5株放線菌命名為Z-2、Z-4、Z-6、Z-E、XW5，具體抑菌數據見表2。結果表明，菌株Z-4、Z-E、XW5對腐爛病的抑制效果較好，但經過血平板培養后，Z-4出現溶血環，具有細胞毒性;Z-E、XW5對蘋果腐爛病的抑菌率達到46.62%、50.41%，且沒有溶血性，可進行后續的工作實驗。本次實驗選擇Z-10菌株開展后續工作。

2.2 黃腐酸鉀單因素抑制蘋果腐爛病效果

28℃恒溫培養后，不同濃度黃腐酸鉀對蘋果腐爛病的抑制作用結果如表3所示。

從表3可以看出，隨著黃腐酸鉀濃度的增大，對蘋果腐爛病的抑制作用逐漸增強。0.3%黃腐酸鉀的抑菌率達到85.88%，當黃腐酸鉀濃度達到0.4%時，抑菌率突破90%，隨著濃度越來越大，抑菌率也越來越強，0.9%的黃腐酸鉀濃度達到100%抑菌效果。

2.3 殼寡糖單因素抑制蘋果腐爛病效果

28℃恒溫培養后，不同濃度殼寡糖對蘋果腐爛病的抑制作用結果如表4所示

從表4的結果可以看出，隨著殼寡糖濃度的增高，對蘋果腐爛病的抑制作用逐漸增強。殼寡糖濃度為0.1%時，表現出較強的抑菌效果，達到61.25%;殼寡糖濃度0.4%時，對蘋果腐爛病的抑制率達到了100%。

2.4 正交試驗實驗結果

不同濃度黃腐酸鉀、殼寡糖和放線菌菌液組合正交結果如表5所示。

此實驗中，3個因素對蘋果腐爛病抑菌率的影響順序為A>B>C，最佳組合水平為A2B2C2。根據方差分析結果顯示各因素水平之間抑菌率并無顯著性差異。從經濟成本角度來說，低濃度的各因素能夠滿足抑菌要求，所以生產的最佳因素組合為A1B1C1，即黃腐酸鉀濃度0.3%、殼寡糖濃度0.1%、放線菌菌液濃度為1.25×10-3mg/mL。

3 討論

殼寡糖相比于殼聚糖而言，應用于植物病害防治及其它各方面更為廣泛。殼聚糖和殼寡糖對于多種微生物都具有廣譜的抑菌活性，但殼聚糖的分子量較大，粘度高，不溶于水和堿性介質，只能溶于酸溶液;殼寡糖分子量小，能夠進入細胞進行調節，溶于水、無毒無害，所以殼寡糖用來防治蘋果腐爛病是較好的選擇。

黃腐酸作為一種富含高活性的腐植酸，在農業上的應用更為廣泛，其不僅包含腐植酸的一般性質，更具有分子量小，容易滲透進細胞，使病菌的DNA復制受到抑制，含活性官能團較多，水溶性好等特點，能夠增強作物免疫力，提高抗病能力，所以應用更加廣泛[11]。

目前，微生物應用于植物病害防治中已經十分廣泛，放線菌作為自然界中廣泛存在的微生物，很早就被應用到植物病害的防治中。孫現超等[12]分離了一株放線菌JY-22發酵液對馬鈴薯干腐病菌絲生長有很強的抑制作用，對馬鈴薯干腐病有顯著的抑制作用，達到74.5%。魏利輝等人[13]公開了一種能夠防治灰霉菌的放線菌菌株及放線菌菌劑，作為一種新型農業殺菌劑，對灰霉病菌抑制率達到60%以上。上述2個放線菌抑菌實驗中都是以放線菌的發酵液探索病原菌抑制效果，發酵液中代謝產物對抑制病原菌起重要作用。本研究從土壤中篩選出一株拮抗放線菌，命名為XW5，并通過平板對峙法初步測定了拮抗菌本身對蘋果腐爛病的抑菌率，抑菌效果達到50.41%，有很高的利用價值。黃腐酸和殼寡糖在防治植物病害中也有研究，陳臻等人[14]用黃腐酸處理蘋果腐爛病菌，黃腐酸能夠顯著提高蘋果樹體內相關防御酶系的活性，提高了植物的免疫力，增強了蘋果樹的抗病性;陸陽[15]將殼寡糖與青霉菌組合防治蘋果腐爛病，發現防治效果明顯高于二者單獨施用。本實驗將放線菌與黃腐酸鉀、殼寡糖結合使用抑制蘋果腐爛病，通過單因素實驗選擇不同濃度的黃腐酸鉀、殼寡糖與拮抗放線菌設計正交實驗，組合探索蘋果腐爛病抑制效果。實驗結果表明黃腐酸鉀濃度0.7%、殼寡糖濃度0.4%、放線菌液10-1抑菌效果較好。從經濟成本角度來說，低濃度的各因素能夠滿足抑菌要求，即黃腐酸鉀濃度黃腐酸鉀濃度0.3%、殼寡糖濃度0.1%、放線菌濃度為1.25×10-3mg/mL便能有效抑制蘋果腐爛病，且抑菌率達到77.85%。

放線菌應用于植物病害防治中已經十分廣泛，黃腐酸和殼寡糖也在植物病害的防治中展示出優勢。本次實驗從土壤中分離出一株對蘋果腐爛病有抑制作用的放線菌，并將其與黃腐酸鉀和殼寡糖結合使用抑制蘋果腐爛病，在實驗室階段對其抑制作用進行了初步的鑒定，田間防治蘋果腐爛病的效果將待進一步研究，以期能為后續黃腐酸鉀和殼寡糖更好地應用于生物防治提供參考。

參考文獻

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（責任編輯 常陽陽）