高效液相色譜法同時測定煙用甘草提取物中14種活性成分

王麗達，蔣成勇，楊振民，易小麗，蘆 楠，嚴莉紅

(上海煙草集團有限責任公司 技術中心北京工作站，北京100121)

甘草提取物作為藥用型添加劑已被廣泛用于煙草、醫藥、食品、化妝品等行業，其活性成分主要有三萜皂苷類化合物(甘草酸、甘草次酸等)、甘草黃酮、甘草多糖等，具有補脾益氣、滋咳潤肺、清熱解毒、調和諸藥等功效[1-4]。煙草中的甘草提取物可有效降低卷煙煙氣中的自由基等有害化合物，顯著提高卷煙產品的安全性[5-6]，還可以起到增香、保潤的作用[7-8]。

目前，煙用甘草提取物的質量監控主要通過折光指數、相對密度、酸值等理化指標及安全性這兩個環節來控制。常規的質量判定不能準確反映甘草提取物的內在質量及其波動，也不能從化學組成的角度對其中活性成分的差異做出定性、定量的解釋[9-11]。因此，監測活性成分的含量變化，對于控制煙用甘草提取物進貨質量、保障卷煙產品質量的穩定具有相當重要的應用意義。

甘草提取物中活性成分的測定方法主要有比色法[12]、薄層掃描法[13]、毛細管電泳法[14]和液相色譜法[15-17]等。但是，大多數文獻報道僅局限于測定甘草提取物中的一種或幾種成分[18-20]，無法滿足煙用甘草提取物中活性成分快速測定的要求。

本工作采用高效液相色譜法同時測定煙用甘草提取物中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、新異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、刺甘草查爾酮、異甘草素、甘草酸、甘草香豆素、甘草查爾酮A、光甘草定和甘草次酸等14種活性成分的含量，旨在為進一步研究煙用甘草提取物質量監控、提升卷煙產品內在質量提供技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Accela型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；HNY-100D 型恒溫振蕩器；D-78224型超聲波清洗儀；Milli-Q 型超純水儀。

14 種活性成分的混合標準儲備溶液:含60.6 mg·L－1芹糖甘草苷、50.4 mg·L－1甘草苷、63.6 mg·L－1芹糖異甘草苷、47.0 mg·L－1異甘草苷、45.8 mg·L－1新異甘草苷、28.0 mg·L－1甘草查爾酮B、45.4 mg·L－1甘草素、36.8 mg·L－1刺甘草查爾酮、48.6 mg·L－1異甘草素、557.4 mg·L－1甘草酸、19.0 mg·L－1甘草香豆素、20.2 mg·L－1甘 草 查 爾 酮 A、47.0 mg·L－1光 甘 草 定 和34.0 mg·L－1甘草次酸，稱取適量的14 種活性成分的標準品，用80%(體積分數，下同)甲醇溶液稀釋而成。

芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷標準品的純度不小于96%，甘草苷、異甘草苷、甘草查爾酮B、甘草素、刺甘草查爾酮、異甘草素、甘草查爾酮A、光甘草定、甘草次酸標準品的純度不小于98%，甘草酸標準品的純度大于93%，新異甘草苷、甘草香豆素標準品的純度不小于97%。

所用試劑均為色譜純，試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

Diamonsil Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫30 ℃；流量1 m L·min－1；進樣體積為10μL。流動相:A 為0.05%(體積分數)磷酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～3.0 min 時，A 由80%降至73%，保持12.0 min；15.0～17.0 min時，A 由73%降至66%；17.0～22.0 min時，A 由66%降至65%；22.0～30.0 min時，A 由65%降至45%；30.0～48.0 min 時，A 由45%降至20%。檢測波長:276 nm(0～7.0 min)、360 nm(7.0～11.5 min)、276 nm(11.5～16.0 min)、360 nm(16.0 ～27.5 min)、248 nm(27.5～31.0 min)、360 nm(31.0～35.0 min)、276 nm(35.0～38.0 min)、248 nm(38.0～48.0 min)。

1.3 試驗方法

稱取0.100 0 g的取自某卷煙廠化材庫的甘草提取物樣品于25 m L 錐形瓶中，用移液器加入10 m L的80%甲醇溶液，超聲提取30 min 后靜置30 min，取上清液經0.45μm 濾膜過濾后，按色譜條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對14種活性成分的混合標準溶液進行測定，其色譜圖見圖1。

圖1 14種活性成分混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 14 active constituents

按試驗方法對煙用甘草提取物樣品和加標后的煙用甘草提取物樣品進行分析，煙用甘草提取物樣品加標前后的色譜圖見圖2。

圖2 煙用甘草提取物樣品加標前后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the sample of tobacco licorice extract before and after addition of mixed standard solution

2.2 提取方法的選擇

試驗采用超聲(1，10，20，30，40，50 min)和振蕩(0.5，1，2，3，4，5 h)兩種提取方法分別對同一批次煙用甘草提取物樣品進行分析，超聲提取時間對目標物總量的影響見圖3。

圖3 超聲提取時間對目標物總量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on total amount of the target objects

由圖3可知:超聲提取30 min后，目標物的提取基本可以完成。振蕩提取煙用甘草提取物樣品中的活性成分時，目標物總量偏低，提取效率略低。超聲提取利用超聲波產生的強烈振動、空化、擴散、擊碎和攪拌作用等多級效應，增加溶劑穿透力，加速溶質的釋放、擴散和溶解，可以提高提取效率，有效縮短提取時間。試驗選用超聲提取。

2.3 超聲提取條件的選擇

2.3.1 提取溶劑

稱取0.100 0 g同一批次煙用甘草提取物樣品于25 m L錐形瓶中，分別加入10 m L 甲醇、乙醇、水、乙腈、異丙醇作為提取溶劑，超聲提取30 min。上述5種提取溶劑提取煙用甘草提取物時，目標物的總量依次 為23.46，4.68，27.89，6.32，3.45 mg·g－1，提取溶劑的提取能力順序為:水＞甲醇＞乙腈＞乙醇＞異丙醇。其中甲醇對甘草素、異甘草素、甘草酸的提取效率最好，水對芹糖甘草苷、甘草苷的提取效率最好，不同成分在不同溶劑中的溶解度不一樣。試驗選用甲醇和水的混合液作為提取溶劑。

試驗考察了甲醇溶液的體積分數依次為90%，80%，70%，50%，20%時對目標物總量的影響。結果表明:分別以90%，80%，70%，50%，20%甲醇溶液為提取溶劑時，目標物的總量依次為27.76，31.68，30.61，28.71，28.17 mg·g－1，80%的 甲 醇 溶液提取效果最好。試驗選擇提取溶劑為80%甲醇溶液。

2.3.2 提取溶劑的用量

試驗考察了80%甲醇溶液的用量依次為3，5，10，15，20，30，40 m L時對目標物總量的影響，結果表明:80%甲醇溶液用量依次為3，5，10，15，20，30，40 m L 時，目標物總量依次為30.62，30.65，31.68，31.74，31.82，31.83，31.85 mg·g－1。目標物總量變化并不顯著，說明煙用甘草提取物的活性成分較易提取。由于甘草香豆素的含量較低，提取溶劑用量為15 m L時，所對應的峰面積較小，誤差較大，同時提取溶劑為10，15 m L 時，提取效果相當。試驗選擇提取溶劑的用量為10 m L。

2.3.3 正交試驗

為進一步考察提取溶劑中甲醇與水的比例(A)、提取時間(B)、提取溶劑用量(C)等因素對超聲提取煙用甘草提取物活性成分總量的影響，根據單因素試驗結果，以總提取量為指標，采用L9(33)正交法設計試驗。正交試驗結果見表1。

表1 正交試驗結果Tab.1 Results of orthogonal test

由表1可知:各因素對目標物總量的影響順序為提取溶劑＞提取溶劑用量＞提取時間。因此，超聲提取的最佳方案為A2B2C3，提取溶劑為80%甲醇溶液。因為甘草香豆素在15 m L 提取溶劑中峰面積較小，誤差較大，同時10 m L 和15 m L 用量的提取效果相當，試驗選用10 m L 提取溶劑，在超聲條件下提取30 min。

正交試驗方差分析結果見表2，其中“??”表示提取溶劑中甲醇體積分數的改變對活性成分提取總量顯著性相關。

表2 正交試驗方差分析結果Tab.2 Results of variance analysis of orthogonal test

根據正交試驗方差分析結果進行F 檢驗，結果表明:提取溶劑中甲醇體積分數的改變對活性成分提取總量有顯著影響；另外兩種因素對提取總量無顯著影響。因此，不必再進行各因素水平間的多重比較。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按色譜條件對14種活性成分的混合標準溶液系列進行測定，以14種活性成分的質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。14種活性成分的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表3。

以3倍標準偏差和10倍標準偏差分別作為方法檢出限(3s)和測定下限(10s)，結果見表3。

表3 線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗

按試驗方法對煙用甘草提取物樣品進行分析，同時進行加標回收試驗，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表4。

表4 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

表4(續)

由表4可知:回收率為91.7%～143%，RSD 為1.2%～6.0%。

2.6 方法的穩定性

將煙用甘草提取物樣品密閉于2 m L棕色色譜小瓶中，于4 ℃冷藏保存，分別在第1，2，3，4，5 d按試驗方法進行分析。結果表明:第1，2，3，4，5 d的目標 物 總 量 依 次 為31.68，31.65，31.87，31.83，31.69 mg·g－1。

隨著樣品放置時間的延長，目標物總量并沒有發生明顯改變，說明提取后的樣品穩定，本方法穩定性較好。

2.7 樣品分析

按試驗方法對10個連續進貨批次的煙用甘草提取物樣品進行分析，結果見表5。

表5(續) mg·g－1

由表5可知:不同煙用甘草提取物樣品的活性成分含量存在明顯差異。這是由于甘草提取物的質量受原材料產地、土壤、種質、炮制、保存、制劑過程等因素的影響，其活性成分含量會有很大差異，甘草提取物添加到卷煙產品后，會直接影響卷煙產品質量的穩定性。

本工作建立了高效液相色譜法同時測定煙用甘草提取物中14種活性成分含量的方法。本方法操作簡便、準確度高、重復性好，可適用于煙用甘草提取物中活性成分的快速測定，并且可為煙用甘草提取物的品質監控提供技術支持。