LMP/TAP基因多態性與甲狀腺癌易感的相關性研究

蔣潔　王丹妹　牛海艷　蔡仁?！∽T蓉　黃用豪

【摘要】 目的 為探討低相對分子質量蛋白酶體（LMP）和抗原處理相關載體（TAP）基因單核苷酸多態性（SNP）與甲狀腺癌易感性的關系， 為我國人類基因組多樣性的研究提供理論依據。方法 124例甲狀腺癌患者設為病例組， 另選取111例健康人群設為對照組， 采用聚合酶鏈式反應（PCR）酶切片段長度多態性（RFLP）對LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中研究最多的四個多態性位點片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）進行檢測， 并對其易感性進行分析。結果 遺傳多態性分析和單倍型聯合分析結果均表明， 四種多態性位點與甲狀腺癌的發生無顯著相關性（P>0.05）。結論 說明選擇分析的Codon60/Codon145/Codon333/Codon637這四種多態性位點片段與甲狀腺癌的發生可能不存在關聯性。

【關鍵詞】 低相對分子質量蛋白酶體;抗原處理相關載體;基因單核苷酸多態性;甲狀腺癌

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.13.041

低分子量蛋白酶體（Low Molecular Proteasome， LMP）和抗原處理相關運載體（Transporter associated with Antigen?Processing， TAP）基因單核苷酸多態性與微生物感染和一系列免疫相關性疾病的發生有著密切關聯[1， 2]， 但目前國內外的研究尚未有與甲狀腺癌感染的易感性關聯的報道， 為此本研究選取LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中四個多態性位點片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）， 對海南省疾病預防控制中心收集的124例甲狀腺癌患者進行了SNP位點的檢測， 并對其進行了易感性的關聯分析。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 納入2017年6月～2019年6月收治的124例甲狀腺癌患者設為病例組， 另選取同期體檢的111例健康人群設為對照組。病例組男28例， 女96例;年齡21～69歲， 平均年齡（44.9±12.0）歲。對照組男51例， 女60例;年齡21～71歲， 平均年齡（45.1±12.4）歲。對照組為在海南居住與病例組無直接血緣關系的健康人群， 經病史詢問以及常規體格檢查確定健康狀況良好， 無長期用藥史， 無癌癥病史。本研究經海南省疾病預防控制中心機構審查委員會批準， 獲得書面知情同意。所有研究對象均由海南省疾病預防控制中心協助采集靜脈血。病例組和對照組的人口統計學特征見表1。

1. 2 方法

1. 2. 1 提取基因組DNA 每例研究對象抽取靜脈血

2 ml， 使用全血DNA快速提取試劑盒（亞能生物）， 按照試劑盒操作說明操作。

1. 2. 2 基因多態性分析 提取基因組DNA后， 利用引物對LMP基因和TAP基因的多態性進行基因分型。采用采用PCR-RFLP技術對上述四種多態性進行檢測。反應在50 μl反應混合物進行， 包括基因組DNA 4 μl， 10×PCR緩沖液5 μl， dNTPs（2.5 mM）4 μl， 每個特定引物2 μl， Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.5 μl和ddH2O 32.5 μl。PCR反應條件：94℃預變性3 min， 然后94℃變性30 s，

57℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 共35個循環， 最后在72℃延伸3 min（所有試劑均為Takara公司。PCR儀SureCycler8800為美國AGILENT公司）。擴增后的產物經純化后， 取PCR產物10 μl（DNA約1 μg）， 在不同的條件下， 根據制造商的說明， 使用特定的限制性內切酶消化。消化后的片段在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳， 溴化乙錠染色。通過對所有多態位點的病例和對照組的隨機DNA樣本（n=10）進行直接測序， 確定基因分型的準確性。最后， 利用Phase1.0軟件構建四種基因多態性的單倍型。

1. 3 觀察指標 觀察分析PCR及酶切結果、Hardy-Weinberg平衡檢驗結果、單倍型與甲狀腺癌的相關性、 基因型、等位基因頻率和性別特異性相關分析、遺傳多態性與甲狀腺癌的相關性。

1. 4 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件處理數據。采用χ2檢驗驗證病例組與對照組之間基因型頻數是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。多態性與甲狀腺癌癥之間的相關性以比值比（OR）及其95%置信區間（95%CI）表示， OR值及其95%CI以無條件邏輯回歸模型分析， 均經年齡、性別等混雜因素校正， P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 PCR及酶切結果 本研究選擇了4個非同義編碼SNP。利用RFLP方法， 根據酶片段數目的不同， 確定基因型（純合子和雜合子）。LMP2擴增產物經HhaI酶切后可觀察到3種不同的基因型：367 bp的多態純和型（Leu/Leu）， 208 bp和159 bp兩條區帶的野生純和型（Arg/Arg）;208 bp、159 bp和367 bp三條區帶的雜合型（Arg/Leu）。LMP7擴增產物經BsmI酶切后可觀察到3種不同的基因型：351 bp的多態純和型（Lys/Lys）， 148 bp和203 bp兩條區帶的野生純和型（Gln/Gln）;148 bp、203 bp和351 bp三條區帶的雜合型（Lys/Gln）。TAP1-1擴增產物經Bcl-1酶切后可觀察到3種不同的基因型：430 bp的多態純和型（Val/Val）， 155 bp和275 bp兩條區帶的野生純和型（Ile/Ile）;155 bp、275 bp和430 bp三條區帶的雜合型（Val/Ile）。TAP1-2擴增產物經Acc I酶切后可觀察到3種不同的基因型：357 bp的多態純和型（Gly/Gly）， 94 bp和263 bp兩條區帶的野生純和型（Asp/Asp）;94 bp、263 bp和357 bp三條區帶的雜合型（Gly/Asp）。見表2。

2. 2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 通過對病例組和對照組人群中4個多態位點的基因型數據進行統計分析， 結果表明其等位基因頻數的分布沒有顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

2. 3 遺傳多態性與甲狀腺癌的相關性 4種多態性位點（LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2）的等位基因和基因型頻率在病例組和對照組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。LMP7 AA純合子的基因型頻率高于對照組， OR值5.3 [95%CI（0.5， 52.9）]， 但由于具有該基因型的樣本數太少而不具有統計意義。見表3。

2. 4 基因型、等位基因頻率和性別特異性相關分析

考慮到病例組和對照組在性別分布上的差異， 通過將男性和女性分開來進一步分析數據。當樣本按性別分層時， 得到的結果與上述結果類似， 雖然LMP7在男性組中比較P<0.05， 但由于樣本數量的限制， 認為其不具有統計學意義。其余多態性位點（LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2）的等位基因和基因型頻率在甲狀腺癌患者和對照組之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

2. 5 單倍型與甲狀腺癌的相關性 基于遺傳學的研究， 單個SNP的存在對于復雜性疾病的發生、發展未必是一個個分散性的作用， 相互之間可能存在一定的內在關聯和相互作用。為了研究LMP/TAP基因中四個多態位點的聯合作用， 進行了單倍型聯合分析共有6種單倍體組合， 純和單倍體型出現的頻率相對較低， 而純合子單倍體型可能會增加單倍型頻率估計的不準確性， 從而導致錯誤的推斷， 因而統計將-/Haplotype和Haplotype/Haplotype合并， 并評估了整體單倍型分布于甲狀腺癌的關系。結果顯示， 甲狀腺癌與選取的LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中四個多態性位點片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）可能不存在關聯性。見表5， 表6。

3 討論

甲狀腺癌的發病原因及機制至今仍未闡明， 一般認為在多基因遺傳的背景下， 由自身免疫紊亂所介導， 在感染、精神因素等環境因素作用下發病， 遺傳因素在發病機制中起重要作用[3]。有研究表明：甲狀腺癌的發生發展與某些基因及其基因的多態性有關[4， 5]， 如RET原癌基因、TSHR基因、BARF基因和RAS 基因等。近年來有研究顯示HLA-DQA1、DQB1是甲狀腺癌的易感基因， 但并不能完全解釋甲狀腺癌復雜的遺傳背景[5， 6]。自從發現LMP、TAP在內源性抗原的處理、提呈中所起的關鍵作用以來， 已可見有關文獻報道毒性彌漫性甲狀腺腫（GD）患者淋巴細胞內的mRNA量減少且與其表面表面HLA-Ⅰ類抗原表達減少程度平行;應用雙色-間接免疫熒光技術觀察， 發現LMP2、LMP7過高表達且與HLA-Ⅰ類抗原、TAP1過高平行[6， 7]。這兩項研究所得出不同結論或可用組織取材、人群差異等因素解釋， 但在肯定LMP、TAP在GD發病中充當一定角色這一方面是一致的， 同時亦提示LMP、TAP基因多態性所致的細胞表面HLA-Ⅰ類抗原過低或過高表達， 使胚胎時期產生對自身抗原免疫耐受的缺失或自身免疫傾向而觸發了GD。為此本選擇研究了LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中研究最多的四個多態性位點片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）。

基于遺傳學的研究， 單個SNP的存在對于復雜性疾病的發生、發展未必是一個個分散性的作用， 相互之間可能存在一定的內在關聯和相互作用， 而單倍型則是這種遺傳相互作用與關聯的體現， 所以對于單倍型的研究則能夠揭示多個LMPs和TAPs與疾病的易感關聯[8， 9]。但的研究結果表明LMP/TAP基因多態性與甲狀腺癌無顯著關聯性[10]。本研究收集了124例甲狀腺癌病例樣本， 樣本量大小適中， 因此該結果具有一定的可信度。但是SNP基因的多態性有著與種族、民族、個體差異、不同人群的疾病易感性和藥物治療的敏感性以及對環境反應的分子基礎、地域分布頻率差異性， 因此LMP/TAP基因與甲狀腺癌發生發展中的作用還有待進一步研究。

參考文獻

[1] Nix P， Nicolaides A， Coatesworth AP. Thyroid cancer review： presentation and investigation of thyriod cancer. Int J ClinPract， 2005， 59（11）：1304-1344.

[2] Ferlay J， Bray F， Pisani P， et al. Cancer interplay incidence， Mortality and Prevalence Worldwide M. Lyon： IARC Press， 2001.

[3] 蘇智廣， 張思仲. 人類基因組單核苷酸多態性的研究進展. 生命的化學， 2001， 21（6）：452-455.

[4] 施靜藝， 陳賽娟. 藥物基因組學-指導合理用藥的基因組學. 中華醫學遺傳學雜志， 2002， 19（2）：156-158.

[5] Ho T， Li G， Zhao C， et al. RET polymorphisms and haplotypes and risk of differentiated thyroid cancer. Laryngoscope， 2005， 115（6）： 1035-1041.

[6] 蔡夢茵. LMP、TAP基因多態性與自身免疫病關系的研究進展. 國外醫學內科學分冊， 2001， 28（7）：294-297.

[7] 錢碧云， 陳可欣， 何敏， 等. 天津市區甲狀腺癌流行狀況調查. 中國腫瘤臨床， 2005， 32（4）：218-221.

[8] 王建華， 張濤. 上海市楊浦區2002-2006年甲狀腺癌發病情況分析. 中國初級衛生保健， 2011， 24（1）：63-64.

[9] Iribarren C， Haselkorn T， Tekawa IS， et al. Cohort study of thyroid cancer in San Francisco Bay area population. Int J Cancer， 2001， 93（5）：745-750.

[10] Fehling HJ， Swat W， Laplace C， et al. MHC class Ⅰ expression in ice lacking the proteasome subunit LMP-7. Science， 1994（265）： 1234-1236.

[收稿日期：2020-01-15]