復方仙草顆粒的急性毒性研究

陳少鋒 梁麗清 王 河 黃 鑫 黃國東

廣西國際壯醫醫院，廣西 南寧 530001

糖尿病腎病( Diabetic Nephropathy，DN) 是指糖尿病微血管病變導致的腎小球硬化，又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病的主要并發癥之一，其起病隱匿，病程進展迅速，其患病率更是隨著糖尿病患者人數的增長而逐年升高， 并成為導致終末期腎臟病的重要原因[1]。根據流行病學統計的研究，預計到2030年，世界范圍內的糖尿病患者將達到大約3.66億人，而糖尿病腎病患者將超過1億人[2]。一但患者進入DN蛋白尿期，進行性發展到腎不可逆損害，最終導致終末期腎衰竭。因此，采用早期臨床干預防治DN具有重要意義。復方仙草顆粒由八仙草、三七、薏苡仁、制大黃、黃芪、甘草等組成，為顆粒免煎劑，10g/包，每次1包，每日3次，具有健脾益腎、清熱利濕、活血祛毒的的作用[3]。課題組前期臨床研究發現，復方仙草顆粒在治療慢性原發性腎小球疾病及慢性腎功能衰竭和早期糖尿病腎病方面具有良好的療效[3-7]，并進行了質量標準研究[8]。為評價復方仙草顆粒的安全性，該實驗進行急性毒性研究，通過觀察小白鼠的急性毒性反應，初步評價復方仙草顆粒的口服用藥安全性，為其安全性評價奠定基礎。

1 實驗樣品與材料

1.1 樣品 復方仙草顆粒免煎劑，由廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院生產，批號：20180202。

1.2 實驗動物 SPF級昆明種小白鼠，體重18～22g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004，實驗單位使用許可證號：SYXK(桂)2019-0001。動物分籠飼養、自由飲水，喂大小鼠維持飼料(北京科澳協力飼料有限公司)，實驗動物墊料為玉米芯顆粒(東方特斯特，邳州市小河科技發展有限公司)。動物室溫度(24±2)℃，相對濕度50%～60%，照明時間隨同自然變化。動物室按常規定期消毒。

1.3 儀器 電子稱：型號T-2000(美國雙杰兄弟有限公司)、超純水制造系統(成都越純科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 受試樣品的制備 取100g復方仙草顆粒，加純凈水溶解后，配制到顆粒不能繼續溶解，且剛好能通過灌胃針，配至150mL，濃度為0.67g/mL(為最大濃度),備用。

2.1.2 預實驗情況 選取受試的SPF級昆明種小白鼠9只，禁食12h，隨機分為3組，每組各3只。第一組按照0.4mL/10g一次性灌胃給藥，第二組按照0.4mL/10g 24h內灌胃給藥2次；第三組按照0.4mL/10g 24h內灌胃給藥3次，1d后，觀察小鼠死亡情況。1d后，動物均無死亡，動物飲食和活動正常。預實驗結果顯示，可以進行最大耐受量(maximum tolerated dose,MTD)實驗。

2.1.3 MTD實驗[8]選取受試的SPF級昆明種小白鼠40只，雌雄各半，分成空白對照組雄性組、空白對照組雌性組、給藥組雄性組、給藥組雌性組4組。實驗前禁食12h。實驗時稱取體重，動物體重18～22g，空白對照組灌服純凈水，給藥組灌服受試藥物，濃度為小白鼠能耐受的最大濃度0.67g/mL，每只小鼠給藥體積均為0.4mL/10g 體重，在24h內分3次灌服，灌胃3h后給飼料，自由飲水。連續觀察14d，每天1次，觀察記錄小鼠外觀、行為活動、精神狀態、攝食、飲水、排泄情況，是否有中毒癥狀及死亡情況，同時在第7天、第14天稱量體重。

小鼠的最大耐受量倍數的計算方法如下[9]：

注：20g為小鼠平均體重，50000g為成人平均體重。

2.2 結果 MTD實驗各組動物給藥后均無死亡，給藥后實驗動物均飲食和活動正常，未出現任何中毒癥狀。連續觀察14d ，未出現小鼠死亡。14d后稱量小鼠體重后處死小鼠，解剖后，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃、腸及胸腔、腹腔，各臟器均無異常。實驗前后各組動物體重變化見表1。給藥組動物體重在給藥前、給藥7d后、給藥14d后，分別與空白對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明，給藥后復方仙草顆粒對小白鼠體質量增長無影響。

組別劑量/mL/g小鼠/只給藥前/g給藥7d后/g給藥14d后/g空白對照組♂0.41019.82±1.1030.59±2.1839.55±1.88空白對照組♀0.41020.17±0.8927.71±2.6232.88±1.55給藥組♂0.41020.09±0.7730.40±2.9639.00±2.51給藥組♀0.41020.67±0.7226.88±2.4732.88±1.96

根據臨床經驗，復方仙草顆粒臨床推薦人用劑量為每次10g，每天3次。復方仙草顆粒最大濃度為0.67g/mL,小鼠采用40mL/kg的給藥體積，每天給藥3次，則每只小鼠的耐藥量1.608g/20g。結果經計算，小鼠日給藥最大量為80.4g/kg。以成人每天用量30g來算，小鼠的最大耐受倍數為134倍[9],和雌雄無關。

據《中藥藥理研究方法學》，小鼠的最大耐受量倍數以耐受人用量口服100倍以上安全，本實驗結果表明，復方仙草顆粒對小鼠的最大耐受量倍數為134倍，且受試動物活動，飲食正常，未出現任何中毒癥狀，無動物死亡，提示復方仙草顆粒無明顯毒副作用。

3 討論

中草藥毒性實驗的目的，在于暴露藥物固有毒性，了解毒性性質及程度，為臨床安全提供有效的科學依據，也是研制新藥的基本要求。中草藥毒性實驗根據給藥時間的長短和觀察目的的不同，可分為急性毒性實驗，長期毒性實驗和特殊毒性實驗。急性毒性實驗又分半數致死量(LD50)測定和最大耐受量測定兩種。

據《中藥藥理研究方法學》，最大耐受量測定，即選用臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度，最大體積的藥量單次或24h內2～3次給與動物，記錄動物反應情況計算出總給藥量，并推算出相當于臨床用藥量的倍數。復方仙草顆粒是中藥制劑，毒性很小，無法測出LD50，所以選用最大耐受量的測定來觀察動物對復方仙草顆粒的耐受量，測定出復方仙草顆粒能達到人用量的134倍,和雌雄無關。從而對復方仙草顆粒的安全性做出估計，為臨床用藥提供參考，也為進一步開展復方仙草顆粒藥效學的研究提供科學依據。