新疆哈薩克族風干肉中產蛋白酶乳酸菌的篩選及酶學特性研究

李丹陽，李宇輝，高云云，閆藝，王俊鋼*，盧士玲*

1(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832000) 2(新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子，832000) 3(新疆農墾科學院農產品加工重點實驗室，新疆 石河子，832000)

新疆風干肉是新疆游牧民族的特色肉制品之一，其中以塔城風干肉最為有名。風干肉又分為風干牛肉、風干馬肉、風干羊肉[1]。新疆風干肉的制作主要在秋冬季節，以牛肉、馬肉或羊肉為原料，進行切塊、短時腌制，再經風干后熟制作而成，屬于干腌發酵肉制品。風干肉風味獨特，其揮發性風味物質主要來源于脂肪氧化、香辛料添加及氨基酸Strecker降解[2]。氨基酸的Strecker降解主要是使肉中蛋白質經過降解形成多肽、小肽、氨基酸和胺，蛋白質降解主要是由于肉中內源性的酶以及產蛋白酶微生物的催化[3]。

產蛋白酶乳酸菌所產的蛋白酶可以在肉制品發酵過程中對蛋白質進行降解，是肉制品風味形成的基礎。TODOROV等[4]研究表明，乳酸菌通過引起pH降低來影響蛋白質降解，從而導致肌肉蛋白酶的活性增加。更重要的是，乳酸菌所產的蛋白酶吸收了由肌肉蛋白水解產生的肽，并將這些肽在細胞內分裂成氨基酸，轉化為芳香成分。乳酸菌蛋白水解系統按其功能可分為3個部分：首先，細胞外蛋白酶作用于底物蛋白并將肉蛋白分解為肽；第二，肽酶水解肽；最終，分解產物穿過細胞質膜[5]肽是肉味物質的前體[6]。乳酸菌蛋白酶在發酵過程中促進了游離氨基酸和短肽濃度的增加[7-8]，對發酵肉的成熟具有積極作用[9]，而其代謝產物則促進了風味的形成[10]。周才瓊等[11]對酸肉發酵過程中揮發性風味物質形成的研究得出結論，通過微生物生長繁殖分泌胞外酶，導致脂肪及蛋白質降解，產生與發酵風味形成有關的醛、酮、醇、酸等物質，并發生酯化反應，形成了酸肉的特有風味。ESSID等[12]從突尼斯傳統咸肉中分離出具有良好抗菌性和耐酸性的乳酸菌，并且所分離的乳酸菌都具有良好的水解酪蛋白的能力。林偉濤等[13]從中式發酵香腸中分離篩選出具有當地特色的自然發酵香腸風味乳酸菌，它們都具有很好的產酸和產酶特性。SUN等[14]從哈爾濱干香腸中分離出1株乳酸菌產蛋白酶可以水解肌原纖維和肌漿蛋白，所產蛋白酶在pH 6和40 ℃下具有活性。有關新疆風干肉中分離乳酸菌的研究主要集中在乳酸脫氫酶、亞硝酸還原酶和酯酶的特性方面[1]，對新疆傳統風干肉中產蛋白酶乳酸菌對其品質影響的機制尚不明確。

本實驗以新疆風干肉中高產蛋白酶乳酸菌為研究對象，系統研究了菌株產酶特性和蛋白酶性質，以期為風干肉的工業化生產提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 實驗原料、培養基與試劑

1.1.1 實驗原料

風干牛肉和風干馬肉樣品：購于新疆塔城、額敏、富蘊、托里地區。

1.1.2 培養基

MRS肉湯、MRS固體培養基：青島海博生物技術有限公司；MRS脫脂乳固體培養基：在MRS固體培養基中加入體積分數為1%的脫脂乳。

1.1.3 試劑

福林試劑、無水Na2CO3、三氯乙酸、NaOH、濃HCl、H3PO4、乳酸、乳酸鈉、冰乙酸、干酪素、L-酪氨酸、無水乙醇、EDTA等，均為國產分析純；細菌DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMaster Mix (Dye Plus)，南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖西班牙，Biowest公司。

1.2 儀器與設備

22331型高速冷凍離心機，德國Eppendorf AG公司；HP1020凝膠成像系統，美國BIO-RAD伯樂公司；T100型PCR儀，美國BIO-RAD伯樂公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡，奧林巴斯(廣州)工業有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；EONC酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；水平電泳槽(小型)，美國Bio-Rad公司；核酸測定儀，美國賽默飛世爾科技公司；UB-7型pH計，美國賽多利斯丹佛公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的篩選分離、純化與鑒定

參考林偉濤等[13]的方法并作適當修改。在無菌條件下取10 g風干肉樣品充分剪碎，放入滅菌后的90 mL生理鹽水中，37 ℃、120 r/min培養24 h。吸取1mL菌液用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，每次稀釋均需用旋渦振蕩器儀充分混勻并更換無菌槍頭。分別吸取10-5～10-7梯度的稀釋液200 μL稀釋液均勻涂布于MRS培養基中，每個梯度做3個平行，于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取不同形態的菌落進行劃線培養，重復劃線多次，直至用顯微鏡觀察至純種，記錄其菌落、細胞形態。挑選純化好的菌株進行革蘭氏染色以及H2O2實驗，選擇革蘭氏染色呈陽性，H2O2實驗呈陰性的乳酸菌用體積分數50%甘油/菌液(體積比為1∶1)于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 乳酸菌菌株生物學鑒定

1.3.2.1 乳酸菌DNA的提取

使用細菌基因組 DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技限公司。按照說明書操作步驟提取樣品中乳酸菌DNA。

1.3.2.2 16S rDNA測序鑒定

采用通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r:(5’CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)，預變性95 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火50 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 4 min共35個循環；最后72 ℃延伸10 min[15]。PCR產物經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海生工生物科技有限公司進行測序，測序結果提交至 GenBank 數據庫中進行序列同源性比對(BLAST)，并用 MAGE 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.3.3 產蛋白酶乳酸菌的篩選

1.3.3.1 產蛋白酶乳酸菌的初篩

將保藏好的菌株以4.0%的接種量接入MRS液體培養基，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，在MRS固體培養基上進行多次劃線至單菌落，挑單菌落到MRS液體培養基中于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。參考SUN等[14]方法并作適當修改，采用牛津杯法初篩產蛋白酶高的菌株，配制好脫脂乳MRS固體培養基進行倒板，將滅好菌的牛津杯放在培養基上，吸取已活化好的乳酸菌10 μL加入牛津杯中，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后觀察并測量透明圈的直徑。

1.3.3.2 產蛋白酶乳酸菌的復篩

參照張曉燕[16]的方法初篩，得到22株產透明圈大的菌株進行蛋白酶活力的測定。

1.3.3.3 粗酶液的提取

參照FARHIDIAN等[17]的方法分離粗蛋白酶，進行少量修改。菌液添加到干凈的離心管中，然后在4 ℃下以 10 000 r/min 離心10 min。所獲得的上清液是粗制的細胞外蛋白酶提取物，保存在4 ℃ 下直至后續使用(12 h內使用)。

1.3.3.4 蛋白酶活力的測定[16]

按照國標GB/T23527—2009規定的福林酚顯色法(Folin)測酶活力。蛋白酶活性定義：在pH 7.0和40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。同一個樣品測3次，取平均值。

酶液適當稀釋，取4支試管編號，1號為空白對照，分別加入1 mL酶液，立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，使酶失活。另3支試管中加入pH 7.0、質量濃度為20 g/L的酪蛋白溶液1 mL，充分振蕩后，置于40 ℃恒溫水浴中保溫反應10 min后，取出加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，終止反應。同時在1號試管中加入20 g/L酪蛋白溶液1 mL，混勻后放入水浴中繼續保溫20 min，取出冷凍離心除去反應沉淀，取離心后濾液1 mL移入干凈的4支新試管中，再加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5 mL和稀釋度為1∶2的Folin試劑1 mL，充分搖勻，保溫顯色20 min后，迅速冷卻測定吸光值(OD680nm)。根據標準曲線，得到酪氨酸相當量。按公式(1)計算：

(1)

式中:K,標準曲線斜率的倒數；4,4 mL反應液取出 1 mL測定(即 4倍)；n,酶液稀釋的倍數；10,反應10 min。

1.3.4 乳酸菌生物學特性分析

1.3.4.1 菌株最適生長溫度

參照桑鵬等[18]的方法并做適當修改。按4.0%的接種量接于MRS液體培養基中，置于不同的溫度(25、30、37、40、50、55、60 ℃)下搖床培養 24 h，然后在波長600 nm 處測定各個溫度下菌株生長的吸光度值，以確定菌株的最適生長溫度。

1.3.4.2 pH對乳酸菌生長的影響

參考張大為等[19]的方法并作適當修改。用冰乙酸將MRS液體培養基的pH值分別調節為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，以pH為6.0的自然培養作為對照，每個梯度3個平行。向液體培養基中接種分離純化的乳酸菌，放于 37 ℃的培養箱培養 24 h，測定600 nm處的吸光值。

1.3.4.3 乳酸菌耐鹽能力的評價

參考張大為等[19]的方法并作適當修改。向質量濃度為10、20、30、40、50、 60和70 g/L的 MRS 液體培養基中接種分離純化的乳酸菌，各留1支做空白試驗，放于37 ℃培養箱培養24 h，在波長為600 nm處測量吸光值。

1.3.5 蛋白酶酶學性質的研究

1.3.5.1 溫度對酶活力的影響[14]

以10 000 r/min，4 ℃，10 min提取粗酶液，分別在0～60 ℃條件下測定酶活力。

1.3.5.2 pH對酶活力的影響[14]

以10 000 r/min，4 ℃，10 min提取粗酶液，用不同緩沖液調整粗酶液的pH為0～11，在最適溫度下測定酶活力。

1.3.5.3 金屬離子和抑制劑對蛋白酶活性的影響

參照SUN等[14]的方法并作適當修改。金屬離子和抑制劑對蛋白酶活性的影響的實驗進行3次平行，3次重復。將濃度為1和10 mmol/L不同的金屬離子(Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+)和抑制劑EDTA溶解在 pH值為6.8的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液中的20 g/L酪蛋白溶液中，以測定其對蛋白酶活性的影響。隨后，將粗酶液與每種離子的氯化物鹽溶液(1 mL)或蛋白酶抑制劑在37 ℃孵育30 min，然后對蛋白酶的活力進行測定。以沒有添加任何金屬離子或抑制劑的蛋白酶活性定義為 100%,作為對照。

1.4 數據與處理

使用Origin 2017作圖，利用SPSS 25.0進行差異性分析；實驗數據均進行3次平行3次重復，以平均值±標準偏差表示，利用 MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。數據分析過程中，當P<0.05，具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

從樣品中共分離得到161株純培養物，經過革蘭氏染色和過氧化氫酶生理生化實驗，初步鑒定149株乳酸菌。通過16S rDNA基因檢測分析，確定149株乳酸菌。其中優勢菌種為糞腸球菌39株約占26%，乳酸乳球菌28株約占19%，格氏乳球菌22株約占15%，植物乳桿菌18株約占12%，其余分別為戊糖片球菌10株、耐久腸球菌9株、腸系膜明串珠菌8株、路德維希腸桿菌6株、發酵乳桿菌5株、副干酪乳桿菌3株、羅伊氏乳桿菌1株。

2.2 產蛋白酶乳酸菌的篩選

根據制作酪氨酸標準曲線的方法，得出酪氨酸標準曲線線性回歸方程為y=0.005 2x-0.004 1，線性相關系數R2=0.999 2，表明線性關系良好。

在所篩選的乳桿菌中初篩出22株在脫脂乳MRS瓊脂培養基中有明顯透明圈的菌株，如圖1所示。用福林酚法對初篩的22株菌株產蛋白酶活性進行定量，實驗結果顯示出5株產蛋白酶較高的菌株分別是乳酸乳球菌A-6、A-18，格氏乳球菌B-2，耐久腸球菌G-11，戊糖片球菌C-1。菌株產蛋白酶活力見表1。

a-空白;b-脫脂乳瓊脂培養基;c-脫脂乳MRS培養基圖1 乳酸菌水解脫脂乳產生透明圈的情況Fig.1 The transparent circles produced by the hydrolysisof skim milk by lactic acid bacteria

表1 菌株產蛋白酶的酶活力Table 1 Activity of protease produced by the strain

菌株酶活力/(U·mL-1)菌株酶活力/(U·mL-1)乳酸乳球菌A-2415.33±0.98de格氏乳球菌E-1212.68±1.21bc乳酸乳球菌A-169.89±0.12a糞腸球菌F-817.26±0.22e糞腸球菌F-612.33±1.01bc糞腸球菌F-1319.98±0.39fg屎腸球菌F-718.96±0.43f耐久腸球菌G-1127.79±0.49h植物乳桿菌J-1310.22±0.78b耐久腸球菌K-318.43±0.74f植物乳桿菌J-313.42±0.13c耐久腸球菌K-713.66±0.59c植物乳桿菌C-1818.26±0.56f戊糖片球菌C-130.77±0.43i乳酸乳球菌A-628.34±0.45hi戊糖片球菌A-31-115.43±0.42de乳酸乳球菌A-1832.46±0.70j乳酸乳球菌E-720.21±0.41g格氏乳球菌B-228.97±0.32hi乳酸乳球菌E-1518.99±0.59f格氏乳球菌E-814.35±0.61d格氏乳球菌E-1815.34±0.67de

注: 同一欄中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)

2.3 菌株生物學特性分析

2.3.1 菌株的最適生長溫度

圖2為溫度對菌株的影響。從圖2可知，5株菌在25～40 ℃，隨著溫度的上升生長量也迅速上升(P<0.05)，乳酸菌在40 ℃，MRS液體培養基中，600 nm下的吸光值達到最大，說明5株菌的最適生長溫度都為40 ℃左右。在40 ℃以后，菌株的生長量隨著溫度的升高逐漸下降，到45 ℃之后5株菌幾乎都停止生長(P>0.05)。在整個考察范圍內菌株A-18具有較好的生長活性。

圖2 溫度對菌株生長的影響Fig.2 Effect of temperature on strain growth

2.3.2 pH對菌株生長的影響

乳酸菌的大量繁殖使得肉中pH降低[20]，因此確定菌株的耐酸性十分重要。將5株菌株接種于不同pH的培養基中，培養24 h。從圖3可以看出，5株菌中G-11的耐酸能力較弱，其余4株菌A-6、A-18、B-2、C-1都具有較好的耐酸能力，在pH值為3.0～3.5的范圍內仍能生長，在pH值為1.5～2.5時菌株基本不生長。羅強等[21]在乳酸菌耐酸能力實驗中對乳酸菌在pH 2.0條件下生長情況進行研究，發現pH 2.0時菌株存活率在70%，這可能是不同乳酸菌對酸的耐受性是不一致的。翟磊等[24]在乳酸菌耐酸能力實驗中得出在pH低于2.0時菌株基本不生長，在pH值為3.0～3.5的范圍內仍能生長。這與本實驗研究結果相似。通過分析比較得到5株菌在整個pH值考察范圍內，菌株A-18和菌株C-1的耐酸能力較強(P<0.05)。

圖3 不同pH值對菌株生長的影響Fig.3 Influence of different pH values on strain growth

2.3.3 菌株耐鹽能力

鹽脅迫引起的滲透壓變化會引起乳酸菌細胞結構損傷，導致細胞生理代謝活動紊亂甚至死亡，因此，乳酸菌在鹽脅迫條件下生存、生長和代謝的能力在食品發酵過程中是非常重要的[23]。將5株菌分別接種于不同鹽濃度的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h考察各菌株對不同鹽濃度的耐受性,如圖4所示。

圖4 不同鹽濃度對菌株生長的影響Fig.4 Effects of different salt concentrations on strain growth

5株菌隨著鹽質量濃度和發酵液滲透壓的增加，生長逐步受到抑制，在鹽質量濃度為10～30 g/L的范圍內時，5株菌均生長良好，在30～40 g/L的范圍內時，菌株生長受到了抑制。鹽質量濃度在40 g/L以上時菌株停止生長(P<0.05)。張大為等[19]在乳酸菌耐鹽能力實驗中得出鹽質量濃度在10～3 g/L之間，菌株均生長良好，鹽質量濃度達到30～4 g/L時，菌體能夠生長，但生長受到抑制。在整個鹽濃度考察范圍內，5株菌中，菌株C-1和菌株B-2的耐鹽能力較優(P<0.05)。

2.4 菌株蛋白酶的酶學性質

2.4.1 溫度對酶活力的影響

從圖5所示，在4～10 ℃低溫條件下，5株菌的蛋白酶活性均受到抑制，但是在低溫范圍內，蛋白酶仍具備一定的活性，但活性較低。在10～40 ℃的溫度范圍內，隨著溫度的升高，5株菌的酶活力都呈明顯上升趨勢(P<0.05)，40 ℃時酶的活力達到最高，如圖5所示。在40～60 ℃范圍內，隨著溫度的升高，蛋白酶的活力逐漸下降。說明40 ℃為蛋白酶的反應活力最強。

圖5 溫度對蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of protease

2.4.2 蛋白酶的最適反應pH

培養基的初始pH會影響各種生長因子在細胞膜上的轉運過程，這可能會對微生物蛋白酶的生產過程產生不利影響。如果微生物處于直接或間接影響微生物蛋白酶活性的最佳pH，則代謝效率將很高[24],如圖6所示。

圖6 pH對蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on protease activity of strain

在pH值為1～6的范圍內，5株菌株的蛋白酶活力隨著pH的上升均呈上升趨勢(P<0.05)，在pH值為6時蛋白酶活性最強。在pH值為6以上時，蛋白酶活力逐漸下降。說明這5株菌株蛋白酶最適反應pH值均為6，5株菌產生的蛋白酶為酸性蛋白酶。

pH是影響蛋白酶活性的重要指標之一[25]。蛋白酶活性在pH 范圍內的穩定性對于發酵肉制品的質量至關重要，并且嫩度和風味前體也可以得到改善[26]。

2.4.3 金屬離子和抑制劑對蛋白酶活性的影響

肉品加工過程中會使用含Na+、K+、Mg2+的鹽，會影響乳酸菌的蛋白酶活性。金屬離子可能是蛋白酶活性位點的一部分，并直接參與催化過程[28]。在離子濃度為1 mmol/L的條件下研究了各種金屬離子對5株菌株蛋白酶相對活性的影響，如表2所示。在10 mmol/L的條件下研究了各種金屬離子對5株菌株蛋白酶相對活性的影響，如表3所示。以沒有添加金屬離子的蛋白酶用作對照(100%)。

表2 1 mmol/L金屬離子和抑制劑對5株菌株蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of 1 mmol/L metal ions and inhibitors on protease activity of five strains

注: 同一欄中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

表3 10 mmol/L金屬離子和抑制劑對5株菌株蛋白酶活性的影響Table 3 Effect of 10 mmol/L metal ions and inhibitors on protease activity of five strains

Na+和 K+在1和10 mmol/L 濃度下誘導5株菌株蛋白酶活性略有增加(P>0.05)。Mn2+、Cu2+和Fe3+對蛋白酶的活性有抑制作用。與對照相比，5株菌株在Cu2+為1和10 mmol/L的條件下蛋白酶的相對活性抑制明顯(P<0.05)。這可能是由于這些離子與5株菌的蛋白酶側鏈基團之間的牢固結合，從而降低了蛋白酶與其底物之間的結合[29]。SUN等[14]研究表明Cu2+確實會顯著降低蛋白酶的活性。EDTA在濃度為1和10 mmol/L時，對蛋白酶活性降低顯著(P<0.05)，這與YU等[30]報道類似。

3 結論

本研究從新疆哈薩克族風干肉中分離出149株乳酸菌，通過表型鑒定及脫脂乳MRS瓊脂培養基初篩出22株在脫脂乳MRS瓊脂培養基中有明顯透明圈的菌株，用福林酚法對初篩的22株菌株產蛋白酶活性進行定量，實驗結果顯示出5株產蛋白酶活力較高的菌株，5株菌株為：乳酸乳球菌A-6、A-18、格氏乳球菌B-2、耐久腸球菌G-11、戊糖片球菌C-1。

菌株生物學特性分析研究結果顯示，所有菌株的最適生長溫度為40 ℃，5株菌中菌株A-18具有較高的生長活性。菌株耐酸特性分析表示5株菌中株菌中G-11的耐酸能力較弱，其余4株菌A-6、A-18、B-2、C-1都具有較好的耐酸能力在pH值為3～3.5的條件下均能生長，整個pH考察范圍內菌株A-18和菌株C-1的耐酸能力較強。菌株耐鹽特性分析表示在鹽濃度為10～30 g/L的范圍內時，5株菌均生長良好，具有一定的耐鹽能力，在整個鹽濃度考察范圍內，5株菌中，菌株C-1和菌株B-2的耐鹽能力較優。

對蛋白酶酶學特性分析表示菌株產生的蛋白酶在40 ℃的反應活力最強并且5株菌所產的蛋白酶均為酸性蛋白酶。Na+和K+在1和10 mmol/L濃度下誘導蛋白酶活性略有增加(P>0.05)。Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+對蛋白酶的活性有抑制作用。相比較之下Cu2+的存在對蛋白酶抑制作用明顯(P>0.05)。

根據研究結果乳酸乳球菌A-18、戊糖片球菌C-11產蛋白酶含量較高，具有較好的耐酸耐鹽特性，可作為潛在益生菌用于后續發酵肉制品品質控制的研究。