白藜蘆醇對糖尿病小鼠腎臟自噬水平及腎間質纖維化的影響*

趙俊琳， 張瑩瑩， 段玲弟， 趙思琪， 阮媛媛， 彭 燦， 張 帆， 郭 兵

（貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，貴州貴陽550025）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種目前在全世界范圍內發病率呈持續增長的慢性內分泌紊亂性疾病，而糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是DM較為常見的微血管并發癥，也是導致終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）及死亡的主要原因之一［1］。腎小管間質纖維化是DN發展至ESRD的主要病理改變之一，其中腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在促進腎間質纖維化中扮演著重要角色［2］，但是其具體發生機制迄今尚未充分闡明。自噬是一種保守的蛋白降解過程，細胞利用溶酶體清除衰老的蛋白質及受損的細胞器，對維持自身穩態和細胞完整性有重要意義。既往研究表明，DN大鼠腎組織中的自噬水平顯著受到抑制［3］，而提高其自噬水平能顯著抑制腎纖維化及DN的發生發展［4］，表明自噬與DN的發生發展密切相關［5］。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）別名虎杖苷元，廣泛存在于葡萄等植物中，具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗組織纖維化等多方面的生物藥理活性［6-8］。Res可以防治DN的發展［4，7-9］，但其潛在的機制還不完全清楚。為此本項工作采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）構建1型DM小鼠模型，觀察予以Res干預后對DM小鼠腎臟纖維化病變及自噬水平的影響，旨在進一步明確Res對DN腎間質纖維化的作用，探討其可能的作用機制。

材料和方法

1 動物

健康清潔級雄性6周齡C57BL/6小鼠24只，體重（20±5）g，斯貝福（北京）生物技術有限公司購買，許可證號：SCXK（京）2016-0002。正常飼養在25℃恒溫的設施中，人工光照、陰暗各12 h，給予標準的清潔級飼料，適應性喂養1周。

2 主要試劑與儀器

STZ（Sigma）；Res（純度＞98%；VETEC）用質量分數0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液后備用；抗β-actin抗體（普美生物）；抗α-SMA和抗E-cadherin抗體（Abcam）；抗IV型膠原（collagen type IV，Col IV）抗體（Sigma）；抗微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和抗Snail1抗體（Cell Signaling Technology）；抗beclin-1抗體（Proteintech）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔和羊抗小鼠IgG（博士德）；ECL化學發光試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物研究所）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜 和 Whatman 3MM濾紙（Millipore）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）；TB GreenPremix Ex TaqTMII（TaKaRa）；組織研磨器（新芝）；AU680全自動生化分析儀（Beckman Coulter）；Scope A1正 置 顯微鏡（Zeiss）；凝膠成像系統和熒光定量PCR儀（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 動物模型的制備及分組 將24只C57-BL/6小鼠適應性喂養1周，隨機分為正常對照（normal control，NC）組、DM組和Res組，每組8只。后兩組造模前稱重，禁食6 h，乙醚麻醉，腹腔注射溶于無菌檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5，0.01 mol/L）的STZ（55 mg·kg-1·d-1），連續5 d，復制DM小鼠模型。NC組予腹腔注射等體積STZ溶媒枸櫞酸鈉緩沖液。尾靜脈采血測定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG≥16.7 mmol/L且穩定1周者為造模成功。成模8周后，Res組采取灌胃方式予以Res干預，Res溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉中，灌胃劑量為10 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次，現配現用。DM組和NC組予等體積的質量分數為0.5%的羧甲基纖維素鈉，每日灌胃1次，連續給藥12周后處死所有小鼠。期間所有小鼠予標準飼料喂養，自由飲水，每周監測1次血糖和體重。

3.2 血、尿及腎組織采集 處死前1 d收集24 h尿液并記錄尿量，離心后取部分上清用于檢測尿蛋白；處死前禁食6 h，乙醚麻醉稱重后，眼眶取血，1 467×g離心10 min分離血清檢測生化指標。取血后剪開腹腔暴露雙側腎臟，在冰上輕柔去除腎臟外包膜及周圍脂肪組織，記錄雙側腎臟重量，取部分組織固定于4%的中性甲醛，做成石蠟切片后行病理檢測，其余部分切開腎臟并去除腎髓質，-80℃超低溫冷凍保存，用于提取蛋白和RNA分別行Western blot和realtime PCR檢測。以腎重（mg）/體重（kg）比值作為腎臟指數（kidney index，KI）。

3.3 生化指標檢測 用葡萄糖氧化酶法測FBG，氧化酶法測血清肌酐（serum creatinine，SCr），免疫比濁法測尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER），鄰苯三酚紅鉬法測尿總蛋白（urinary total protein，UTP）。以UTP乘以24 h尿量計算24 h UTP。以UAER乘以24 h尿量計算24 h UAER。

3.4 腎組織形態學觀察 取部分腎組織固定于4%的中性甲醛，經包埋、固定，做成3μm厚的石蠟切片，脫蠟后行HE和Masson染色，普通光學顯微鏡下觀察各組腎組織的形態學變化。

3.5 Western blot法檢測各組腎組織中纖維化指標、EMT指標及自噬標志蛋白的表達水平 稱取0.2 g腎皮質組織于1.5 mL高壓滅菌過的EP管內，加入1 mL組織蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=97∶3），管內放入磁珠，經組織研磨機充分研磨成液體。4℃、13 201×g離心，取上清，BCA法蛋白定量，根據濃度加入適量上樣緩沖液，充分混勻后，100℃沸水中加熱10 min。上樣，經SDS-PAGE分離，以300 mA電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜，10 min，3次，然后分別加 I抗［β-actin（1∶4 000）、LC3（1∶1 000）、beclin-l（1∶1 000）、Col IV（1∶500）、α-SMA（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和 Snail1（1∶1 000）］，4℃孵育過夜。次日回收I抗，TBST洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的II抗（1∶5 000），常溫孵育1 h，洗膜，放入ECL顯影液（1∶1）中，避光混勻，Bio-Rad凝膠成像儀曝光，Image Lab 5.1軟件選中條帶并分析灰度值，結果用目的蛋白與β-actin相對表達量表示。

3.6 Real-time PCR檢測α-SMA、E-cadherin和Col IV的mRNA表達 取0.1 g腎組織皮質部分加1 mL TRIzol提取小鼠腎組織RNA，于核酸蛋白分析儀260/280 nm測定RNA的濃度及純度后，根據Therom試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，然后按照TaKaRa TB GreenPremix Ex TaqTMII 20μL體系試劑盒操作，應用DNAMAN軟件設計α-SMA、E-cadherin、Col IV及β-actin引物，由上海生物工程有限公司合成，用Bio-Rad CFX96TM熒光定量PCR分析系統進行檢測，同時采用熔解曲線分析評價PCR結果的可靠性。PCR程序為：95℃ 3 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個循環；72℃10 s。以β-actin為內參照，待測基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=［Ct目的基因（待測樣品）-Ct內參照（待測樣品）］-［Ct目的基因（校正樣品）-Ct內參照（校正樣品）］。引物序列見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used in real-time PCR

4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據都以均數±標準差（mean±SD）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠代謝及生化指標比較

DM組FBG、KI、SCr、24 h UAER及24 h UTP均顯著高于NC組（P＜0.05），Res組KI、SCr、24 h UAER及24 h UTP均顯著低于DM組（P＜0.05），而DM組和Res組FBG無顯著差異（P＞0.05），見表2。

2 各組腎組織的病理變化

HE及Masson染色可見，NC組小鼠腎小管結構較清晰，上皮細胞排列整齊，基底膜較完整，間質炎性細胞浸潤及膠原沉積不顯著；與NC組相比，DM組小鼠腎小球充血擴張，部分腎小管上皮細胞空泡、壞死、萎縮脫落，腎小管管腔擴張，腎小管及腎間質周圍炎癥細胞浸潤伴有顯著的藍色膠原纖維沉積；與DM組相比，Res組小鼠腎臟病變有所減輕，腎小球充血較輕，腎小管間質纖維化病變亦減輕，膠原沉積減少，見圖1。

表2 各組代謝及生化指標比較Table 2.The kidney index（KI），fasting blood glucose（FBG），24-hour urinary albumin excretion rate（24 h UAER），24-hour urine total protein（24 h UTP）and serumcreatinine（SCr）in each group（Mean±SD.n=8）

Figure 1.The histological changes of the renal tissues in each group.圖1 各組腎組織的形態學觀察

3 各組腎組織中纖維化指標Col IV及EMT相關指標α-SMA、E-cadherin和Snail1的表達水平

DM組腎組織中Col IV、α-SMA和Snail1蛋白表達較NC組顯著上調，E-cadherin蛋白表達較NC組顯著下調（P＜0.05）；而Res組腎組織中Col IV、α-SMA和Snail1蛋白表達較DM組顯著下調，E-cadherin蛋白表達較DM組顯著上調（P＜0.05），見圖2A。DM組腎組織中Col IV和α-SMA的mRNA表達較NC組顯著增高，而E-cadherin的mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與DM組比較，Res組E-cadherin的mRNA表達增高（P＜0.05），而Col IV和α-SMA的mRNA表達降低（P＜0.05），見圖2B。

4 各組腎組織中自噬相關指標beclin-1和LC3-II的蛋白表達水平

與NC組相比，DM組自噬標志蛋白beclin-1蛋白表達減少，LC3-II/LC3-I比值下降（P＜0.05）。與DM組相比，Res組beclin-1蛋白表達顯著增多，LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.05），見圖3。

討 論

DN是ESRD的主要病因之一［1］，其病理改變主要為腎小球硬化和腎間質纖維化，而腎間質纖維化的主要表現為腎小管上皮細胞損傷及大量細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的沉積。腎小管上皮細胞的EMT在促進ECM的沉積、腎間質纖維化及DN的發生與發展中起著重要的作用［2，9］，其中轉錄抑制因子Snail1可能作為EMT的始動因子發揮著關鍵作用［10］。Snail1可以與E-cadherin啟動子區E盒結合，抑制E-cadherin的表達，同時還可以誘導α-SMA的表達。在高糖培養的腎小管上皮細胞中，促進上皮細胞Snail1的表達能促進EMT的發生，而抑制Snail1的表達則能抑制EMT的發生［11-12］。本實驗中DM組的生化指標和病理形態學均提示糖尿病腎病腎間質纖維化動物模型復制成功。與NC組相比，DM組中α-SMA、Col IV和Snail1的表達增加；E-cadherin的表達減少（P均＜0.05），說明在這個過程中發生了纖維化病變及EMT。

自噬是細胞內溶酶體依賴性蛋白降解的兩種途徑之一［13］，在代謝、退行性和惡性疾病等許多生理和病理情況下具有重要作用［14-15］。Huang等［8］檢測到db/db小鼠腎組織中的自噬水平明顯受到抑制，其中beclin-1是自噬啟動的關鍵蛋白，有文獻報道在DN大鼠模型及高糖培養的腎小管上皮細胞模型中beclin-1的表達及自噬水平均明顯降低［5，16］。我們的研究結果顯示，隨著纖維化病變的進展，DM組小鼠腎組織中beclin-1和LC3-II蛋白表達水平較NC組顯著下調，自噬水平減弱。這表明自噬不足可能參與了糖尿病腎纖維化的發生發展，而上調自噬水平可能作為DN治療的一個潛在靶點［5］。另外，增加beclin-1的表達能提高細胞自噬水平，抑制EMT的發生［17］。本研究結果顯示，與NC組相比，DM小鼠腎組織的beclin-1表達減少而Snail1表達水平顯著升高，纖維化病變明顯，提示beclin-1調控的自噬與EMT關系密切。

Figure 2.The protein and mRNA expression levels of fibrosis index collagen type IV（Col IV）and EMT-related indexesα-SMA，E-cadherin and Snial1 in renal tissues of each group.A：the protein levels of Col IV，α-SMA，E-cadherin and Snial1 were determined by Western blot.B：the mRNA levels of Col IV，α-SMA and E-cadherin were determined by real-time PCR.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup；#P＜0.05，**P＜0.01 vs DMgroup.圖2 各組腎組織中纖維化指標Col IV及EMT相關指標α-SMA、E-cadherin和Snial1的蛋白和mRNA表達水平

Figure 3. The protein levels of beclin-1 and LC3 IIin renal tissues of each group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCGroup；##P＜0.05 vs DM Group.圖3 Western blot顯示各組腎組織中自噬相關指標beclin-1和LC3-II的蛋白表達水平

Res是一種來源于花生、葡萄、桑葚等植物的天然多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等功效，有很好的食用價值和藥用價值。近年來國內外研究表明Res具有防治DN的作用［4，18-19］，但是具體機制尚不明確。He等［19］發現Res能抑制高糖培養的腎小管上皮細胞發生EMT。在DN大鼠模型中，Res可通過恢復腎組織自噬水平改善腎功能［4］。我們的實驗結果顯示，DM小鼠接受Res干預后，自噬水平上調，纖維化病變程度顯著減輕。與DM組相比，beclin-1表達水平顯著升高，而Snail1表達減少，纖維化病變及EMT減輕。以上研究結果提示Res可能通過促進beclin-1的表達，上調自噬水平，促進Snail1的降解，減輕腎臟纖維化，抑制DM小鼠腎間質纖維化及EMT的發生發展，從而發揮保護腎臟的作用。

綜上所述，Res對DN的保護作用，可能是通過上調beclin-1介導的自噬水平，下調Snail1的表達，從而延緩腎臟纖維化的進程，對腎臟起到保護作用。但是在DN中，beclin-1與Snail1之間的具體關系還不是很清楚，有待深入研究。