解淀粉芽孢桿菌TF28對設施連作黃瓜根際土壤酶活性和微生物的調節

胡基華　李晶　張淑梅　陳靜宇　曹旭　孟利強　姜威　劉宇帥

摘要：為研究解淀粉芽孢桿菌TF28對設施連作黃瓜根際土壤環境影響，以液體（L）、顆粒（P）和復合（LP）3種處理與沒有施用TF28的空白對照進行對比試驗，測定設施黃瓜生育指標、土壤酶活性及微生物種群數量。結果表明，移栽后2～3周后L、P和LP 3種處理株高分別提高18.78%、17.27%、11.88%;L和LP 2種處理對黃瓜根須數量與空白對照相比分別提高35.20%和48.66%。移栽2～8周，與空白對照相比，P處理對堿性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性高69.43%、77.43%，L處理脲酶活性提高40.99%，LP處理過氧化氫酶活性提高163.24%。與空白對照相比，3種處理都能顯著增加土壤細菌和放線菌數量，降低真菌數量。這說明TF28的添加對連作黃瓜中的酶活性、微生物數量及群落結構有明顯的調節作用。

關鍵詞：黃瓜;連作障礙;土壤理化性質;解淀粉芽孢桿菌細菌;微生物;調節作用

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0152-05

隨著我國設施農業的不斷發展，連作障礙越來越突出[1]。黃瓜作為設施蔬菜主要品種，近年來其連作障礙的發生機制及其防治措施受到學者們較廣泛的關注，已有的研究表明，土壤微生物區系失衡是黃瓜連作障礙發生的主要原因之一[2]，且施用有機肥及微生物肥可有效改善土壤微生物生態環境，能有效解除作物連作障礙[3]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在自然界中分布廣泛，是一類重要的生防資源菌，也是具有較高開發價值的農用微生物[4-6]，在植物病害生物防治方面具有廣闊的應用前景[7]。內生解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的1株內生細菌，具有廣譜抗菌活性[8]，前期研究發現對番茄具有抗病作用，并對生長具有調控作用，同時能提高果實品質[9]。

筆者對菌株TF28以液體（L）、顆粒（P）和復合（LP）3種處理方法與空白對照（CK）進行對比試驗，研究其對棚室連作黃瓜的生長發育、土壤菌群和根跡微生態酶活的變化，找到可以改善棚室連作土壤質量和環境的菌株和方法，從而更有利于設施農業健康發展，實現設施蔬菜生產能力的持續穩定健康發展。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

內生解淀粉芽孢桿菌TF28由黑龍江省科學院微生物研究所黑龍江省生物工程重點實驗室分離保存。本試驗地點在黑龍江省哈爾濱市太平鎮興業村，于2018年2月23日穴盤育苗，4月5日移載到溫室大棚中;黃瓜品種為“早熟綠神”，種子購于哈爾濱全福種苗有限公司。試驗顆粒為腐殖酸顆粒;細菌NYD培養基（貨號BS1002）;PDA培養基（北京陸橋技術股份有限公司）;放線菌培養基（貨號BS1075）。將解淀粉芽孢桿菌TF28制成濃度為108 CFU/mL的菌懸液，置于4 ℃冰箱中待用。試驗用顆粒劑制備：將菌懸液用噴壺均勻地噴涂在腐殖酸顆粒上，制成含菌量為2億～3億CFU/g的顆粒劑，常溫保存備用。

施菌劑方法：（1）液體處理（L），108 CFU/mL菌懸液5 mL澆在苗根部;（2）顆粒劑施肥法（P），移栽時將顆粒劑（2億～3億CFU/g）按5 g/株均勻撒在壟溝，再將瓜苗栽上;（3）復合施用法（LP），瓜苗移栽時，苗根部均勻放置5 g/株顆粒劑（2億～3億CFU/g），將瓜苗栽上后再澆灌5 mL菌懸液（108 CFU/mL）;以清水處理為空白對照。移植第1周和第2周，隨機選取健壯的黃瓜，對株高、葉面積（根部起測量第5張葉片）、根須數量、主根長度和根部干質量等生育指標進行測定，3個重復，每個重復5株;黃瓜果實在移栽第5周測定，共取樣3次，每次取1空（72株/空）成熟果實，黃瓜移栽至大棚后每周取1次土樣，采用5點取樣法取樣，將每個處理5點的土壤樣品混合為1個重復，過2 mm篩，-80 ℃ 凍存備用。

1.2 測定儀器與方法

離心機AIGMA 3-18K（日本）;紫外分光光度計INESA-UV757CRT（青島聚創環保設備有限公司），96孔板Costar 3590，石英比色皿0.35 mL（型號為YA1150，Solarbio北京）。葉面積采用葉面積測量儀YMJ-B（浙江托普儀器有限公司）測量;土壤pH值采用FILDSCOUT pH400 Meter 2109儀讀取;堿性磷酸酶（S-AKP/ALP）活性檢測試劑盒Solarbio（貨號BC0285）、土壤酸性磷酸酶（S-ACP）試劑盒Solarbio（貨號BC0145）、土壤脲酶（S-UE）活性檢測試劑盒Solarbio（貨號BC0125）、土壤過氧化氫酶（S-CAT）活性檢測試劑盒Solarbio（貨號BC0105），4種酶活性測定按規程進行操作，其中脲酶活性測試中37 ℃水浴鍋用37 ℃恒溫培養箱代替。

1.3 數據分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據分析，應用ANOVA單因素（LSD法）進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 TF28對黃瓜生育指標和土壤理化性質的調節作用

施用TF28菌劑2～3周后對黃瓜的葉片、根部采用5點取樣法進行對比，結果（表1）表明，P、LP、L 3種處理株高與空白對照相比分別提高18.78%、17.27%、11.88%;L和LP 2種處理根須數量分別高于空白對照35.20%和48.66%;3種處理對葉面積、果實質量、根長和根質量影響不顯著。

由圖1可見，L處理的pH值為7.35～5.12，移栽后1周最高，7周最低;LP處理的pH值為6.58～5.85，6周最高，5周最低;P處理的pH值6.34～5.23，1周最高，6周最低;CK處理pH值較平穩，在6.18～5.23之間，1周最高，5周最低。

2.2 TF28對連作黃瓜土壤酶活性的影響

由圖2-A可見，3種處理對連作黃瓜根際堿性磷酸酶活性具有調節作用。在移栽后3周，L、P和LP處理的堿性磷酸酶活性都高于CK，其中L處理與CK差異明顯，提高了23.11%;在移栽后6周，L和LP 2種處理的堿性磷酸酶活性呈下降趨勢，P處理呈上升趨勢，與CK差異明顯，提高35.03%;在移栽后7周，LP處理的堿性磷酸酶活性高于CK 24.19%， [CM（17*2]其他2種處理趨于空白對照。 由圖2-B可見，3種處理酸性磷酸酶活性在移栽后2周均提高，L和CK處理差異明顯，提高14.33%;移栽后3周3種處理都高于空白對照，分別提高41.47%、22.20%和77.43%;移栽后4周3種處理仍高于空白對照，其中L處理明顯高于CK，較CK提高17.91%。由圖2-C 可見，L處理的脲酶活性在移栽后4周明顯高于CK 24.34%。由圖2-D可見，L、LP和P 3種處理過氧化氫酶活性都明顯高于CK，分別提高158.70%、163.24%和138.97%;移栽后6周LP處理明顯高于CK 86.15%;移栽后7周L處理明顯高于CK 102.36%;移栽后8周3種處理都明顯高于CK，分別提高83.20%、91.52%和119.62%。

2.3 菌株TF28對黃瓜根際土壤微生物數量的影響

施用TF28菌劑的3個處理對棚室連作黃瓜土壤中細菌、真菌和放線菌具有調節作用，提高細菌和放線菌的數量，降低了真菌的數量。由表2可見，移栽后L處理的黃瓜根際土壤細菌數量從移栽后1～8 周分別比CK增加368.35%、279.21%、256.90%、134.54%、263.43%、90.35%、9.95%和-4.51%;LP處理黃瓜根際土壤細菌分別比CK增加367.57%、378.22%、357.66%、186.91%、254.73%、17.95%、5.30%、-21.83%;P處理黃瓜根際土壤細菌分別比CK增加271.07%、355.05%、252.36%、187.22%、237.85%、64.86%、26.32%和-0.58%。

由表3可見，移栽后L處理的黃瓜根際土壤放線菌數量從移栽后1～8周分別比CK增加125.16%、146.56%、141.14%、123.21%、131.75%、125.79%、69.18%和46.36%;LP處理放線菌數量分別比CK增加52.20%、78.63%、56.96%、125.00%、89.95%、49.69%、64.15% 和30.46%;P處理放線菌數量分別比CK增加159.12%、222.90%、223.42%、215.48%、207.41%、251.57%、45.28%和68.87%。

由表4可見，移栽后L處理的黃瓜根際土壤真菌數量從移栽后1～8周分別比CK降低69.72%、51.52%、46.01%、39.34%、43.41%、35.34%、21.60%和30.29%;LP處理真菌數量分別比CK降低23.85%、41.21%、47.79%、65.57%、77.52%、81.95%、70.04%、65.14%;P處理真菌數量分別比CK降低51.38%、70.91%、70.99%、84.43%、72.87%、63.16%、24.80%和23.43%。

3 討論

植物根際是植物與外界環境交流的主要場所，土壤中微生物的含量與生態系統功能的發揮密切相關，是土壤中有機質養分的一種短暫而最有效的貯存形式[10-11]，同時也是土壤肥力水平的活指標[12]。內生細菌具有在植物體內定殖傳導，不易受外界環境影響等優點，解淀粉芽孢桿菌TF28是廣譜生防菌株，有研究表明接種TF28后能夠提高番茄抗灰霉病能力，番茄葉片防御酶活性及JA（茉莉酸）和SA（水楊酸）含量升高[9]，本試驗對TF28以液體、顆粒劑和復合3種形式施用，可以提高棚室連作黃瓜苗期株高和根須數量，顯著提高設施黃瓜土壤中細菌和放線菌的數量，降低真菌數量，其中以顆粒形式施用比其他2種處理效果要好。說明TF28可以改善棚室連作黃瓜土壤質量和環境，對土壤具有調節作用，利于植株生長發育，可以抑制由于連作引起的由“細菌型”向“真菌型”轉變。已有研究表明，不同作物的根際有其特定的微生物群落，就是同一作物在不同生育時期和營養狀態下，其根際微生物數量也呈現一定的動態變化[13]。微生物數量及多樣性的增加，作用期較短，這與張昕等研究2株生防菌對黃瓜根圍的環境生態效應結果[14]相似，生防菌株的施入對土壤中細菌的種群數量有短期影響，但隨著黃瓜生育期的延長，施入生防細菌土壤的細菌數量最終與對照土壤中細菌數量持平。其原因可能是土壤本身的微生物生態環境有一定的自我恢復能力，在受到外來因素擾動后，短期內出現激烈的變化，但是隨著時間的推移逐步恢復到原有的水平。

土壤酶是土壤組分中最活躍的有機成分之一[15]，酶活性反映土壤物質能量代謝強度[16]。設施蔬菜連作會導致土壤酶活性降低、微生物群落結構單一化、有害微生物數量增多[17-21]。土壤磷酸酶活性可以用來評價土壤磷素狀況[18]，磷酸酶酶促作用能加快土壤有機磷的脫磷速度;堿性磷酸酶作為一種適應酶，當植物缺少磷肥時堿性磷酸酶會增加，其活性會隨著磷素含量的上升而降低[19]。土壤磷酸酶活性與作物的生育期和土壤水分含量、土壤溫度、土壤pH值等多方面因素有關[20-21]。本研究中3種處理均提高了堿性磷酸酶、酸性磷酸酶。在移栽后8周內，所有樣品除了第1周L處理呈堿性，其他樣品都在酸性范圍內，酸性磷酸酶活性L處理在第2周最高，為37 407.71 nmol/（g·d），堿性磷酸酶活性P處理在第6周達到最高值25 684.77 nmol/（g·d），3種處理無論是單個樣品還是8周平均數值，酸性磷酸酶作為優勢酶作用要大于堿性磷酸酶，在苗期酸性磷酸酶呈先升高再降低的趨勢，與戰厚強等的研究結果[22]相同。脲酶是催化尿素水解的唯一酶，可以將酰胺態有機氮化物水解轉化為植物可直接利用的無機氮的酶，脲酶活性可以反映出土壤供氮水平和能力[23]。本試驗結果顯示，L、LP處理脲酶活性在苗期移栽后3、4周與對照差異顯著，說明TF28可以改善棚室連作土壤供氮水平。土壤中的過氧化氫酶活性能夠反映土壤中碳、氮物質的轉化情況[24]。已有研究表明，生物炭的添加對設施連作黃瓜根域基質酶活性和微生物具有調節作用[25]。本試驗中L和LP 2種處理的過氧化氫酶活性在移栽后6、7周達到最高值，說明TF28對碳、氮轉化具有促進作用。

從移栽后連續8周對4種酶活性進行測試，結果顯示，酸性磷酸酶活性在移栽后2周出現最高值，脲酶活性在移栽后3、4周出現最高值，堿性磷酸酶活性在移栽后6周出現最高值，過氧化氫酶活性的最高值出現在移栽后7周，4種酶活性達到最高值的時間有先后順序，依次是酸性磷酸酶、脲酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶，這些活性變化還須要進一步研究其代謝功能來驗證說明。3種處理中P處理能明顯提高堿性磷酸酶，L處理能明顯提高酸性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶。

4 結論

解淀粉芽孢桿菌TF28對設施連作黃瓜根際土壤酶活性、微生物含量和pH值具有調節作用，3種處理中L和P 2種處理效果明顯，可以提高苗期植株株高、苗期根須數量以及土壤中的堿性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性，酸性磷酸酶是主導磷酸酶。施用TF28可提高土壤細菌和放線菌數量，降低真菌數量。8周連續采樣結果顯示，無論是菌群數量、pH值、4種酶活性都呈波浪狀起伏，說明土壤自身調節能力，TF28可以促進土壤自身恢復調節。

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