野生釀酒酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母混菌發酵對玫瑰香葡萄酒香氣的影響

閻賀靜，張鳴宇，孫康，楊曉寬，葛超，周潔芳，劉暢，鄒靜

(河北科技師范學院 食品科技學院，河北 昌黎，066600)

玫瑰香葡萄是麝香類葡萄，具有濃郁的玫瑰香氣，因此不同類型的玫瑰香葡萄酒廣受歡迎。目前我國玫瑰香葡萄酒的釀造均使用活性干酵母(釀酒酵母Saccharomycescerevisiae)作發酵劑，雖然該過程發酵速度快、并易于控制，但容易導致葡萄酒同質化問題，使玫瑰香葡萄酒缺乏品種特色和地域特征。隨著對非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae, NSC)研究的深入，發現許多NSC對葡萄酒的風味和感官具有積極作用[1]。在葡萄自然發酵醪中存在的大量NSC，例如Hanseniasporaguilliermondii(季也蒙有孢漢遜酵母),Torulasporadelbrueckii(德爾布有孢圓酵母),Schizosaccharomycespombe(栗酒裂殖酵母),Zygosaccharomycesbailii(拜耳結合酵母),Candidazemplinina(澤姆普林納假絲酵母),Lachanceathermotolerans(舊稱作耐熱克魯維酵母，Kluyveromycesthermotolerans)和Candidaapicola(蜂生假絲酵母)均具有優良的發酵特性，能夠存活于整個發酵過程[2]。尤其是Lachancea、Metschnikowia、Torulaspora和Pichia等屬的酵母已制備成商業化的菌劑[3]。許多研究證實，對S.cerevisiae和NSC的混菌發酵進行良好的控制，可以大大增加葡萄酒香氣的復雜性[4-5]。這既避免了葡萄酒酸敗的風險，同時又保留了自然發酵的優勢，可以突出葡萄酒的品種特色和地域特征。因此，S.cerevisiae與NSC混菌發酵對特色葡萄酒的釀造具有非常重要的意義。

昌黎是我國歷史悠久的葡萄與葡萄酒產區，種植大量的玫瑰香葡萄。課題組前期從玫瑰香葡萄自然發酵醪中分離獲得了1株S.cerevisiaeHBKS-Y1和1株葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)HBKS-Y3，并對其發酵特性進行了研究[6]。本文進一步考察了HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌發酵過程以及其對玫瑰香葡萄酒香氣的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 原料

玫瑰香葡萄，2016年9月采自昌黎葡萄溝(中國)，含糖濃度235.4 g/L(以還原糖計)、可滴定酸濃度5.10 g/L(以酒石酸計)、pH 3.21。

1.1.2 菌種和培養基

活性干酵母：商用活性干酵母FX10，法國Laffort公司；釀酒酵母HBKS-Y1和葡萄汁有孢漢遜酵母HBKS-Y3，均為本課題組前期從玫瑰香葡萄自然發酵醪中分離獲得[6]，由河北科技師范學院釀酒工程實驗室保藏。

YPD培養基(g/L)：酵母浸提物10，蛋白胨 20，葡萄糖20，瓊脂20(固體培養基添加)。

賴氨酸培養基(g/L)：賴氨酸 5.6，葡萄糖 10，KH2PO40.85，Mg3(PO4)20.5，瓊脂 20。

1.1.3 試劑

甘油和乙醛含量測定試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司;本研究所用其他試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器和設備

7890B-5977氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司;固相微萃取針頭30/40 μm Polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB)，美國 Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵和取樣

玫瑰香葡萄除梗破碎、去皮渣，70 ℃處理30 min，取100 μL涂布于YPD培養基，28 ℃培養48 h檢驗除菌效果[7]。分別在400 mL除菌葡萄汁中接入活性干酵母FX10、HBKS-Y1、HBKS-Y3、HBKS-Y1和HBKS-Y3(接種比例為1∶9)，接種量為106CFU/mL培養基，編號分別為F1、F2、F3和F4， 20 ℃培養至發酵結束，每天定時取樣進行酵母計數。分別取3 L除菌葡萄汁，按以上接種策略接種和發酵，所得酒樣進行理化指標、香氣成分分析和感官評價。

1.2.2 酵母計數

酵母菌總數使用YPD 培養基，H.uvarum的計數用賴氨酸培養基(S.cerevisiae不能在賴氨酸培養基中生長)。發酵樣品用無菌水梯度稀釋，取適合梯度稀釋菌液100 μL 分別涂布于YPD 和賴氨酸培養基，28 ℃培養48 h 后進行計數。

1.2.3 理化指標測定

pH計測定pH，還原糖、乙醇、總酸、揮發酸和比重的測定根據GB/T 15038—2006進行，發酵液中甘油和乙醛含量均采用試劑盒測定。

以上所有實驗均設置3個重復。

1.2.4 香氣成分測定

采用安捷倫90A-5975C氣相色譜儀聯合質譜儀測定酒樣揮發性成分。酒樣離心，取5 mL上清液加入至含有1.0 g NaCl和10 μL 2-辛醇 (內標) 的20 mL樣品瓶中，密封，1 100 r/min攪拌，40 ℃預熱30 min后插入30/40 μm Polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB)固相微萃取頭，40 ℃萃取30 min，然后將萃取頭插入GC進樣口，250 ℃解吸附5 min。色譜條件：載氣為He，流速為1.0 mL/min (不分流)，色譜柱為HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜升溫程序：起始溫度50 ℃，保溫1 min后以3 ℃/min升溫至230 ℃，保溫10 min后以5 ℃/min升溫至250 ℃，保溫3 min 后降溫至40 ℃。質譜條件：掃描范圍為m/z33～450，進樣口溫度250 ℃。揮發性成分的定性分析通過對比質譜庫(NIST)的保留時間，揮發性成分的半定量分析通過內標計算色譜峰面積進行。

1.2.5 感官分析

邀請10位受過專業訓練的人員，采用稍作改良的定量分析法(quantitative descriptive analysis, QDA)[8]對所釀葡萄酒進行感官評價。對酒樣的色澤、花香、果香、玫瑰香、異味、酸度、甜度、酒體及總接受度共9個屬性進行評價，用8分結構化數值進行定量描述，每個屬性得分介于0～8，分值大小表示感官對每個屬性的感知強度。計算每個屬性的平均分值并繪制多邊形圖。

1.2.6 數據處理

采用Excel 2010 進行數據處理，對化學成分和揮發性成分進行方差分析，采用Excel 2010 和Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程分析

圖1為不同發酵過程的還原糖消耗曲線。結果表明，所有野生酵母參與的發酵過程(F2、F3和F4)的發酵速度均比活性干酵母發酵(F1)速度低，其中HBKS-Y3單菌發酵速度最低(F3)，但所有的發酵均能在14 d內完成發酵，且葡萄酒樣符合標準葡萄酒指標要求(表1)。大多數早期研究認為H.uvarum只存在于葡萄酒發酵的早期階段，由于酒精耐性較低及其他原因不能完成酒精發酵[9]。以上的結果說明，本研究中的野生H.uvarumHBKS-Y3具有一定的酒精耐性和發酵能力。

圖1 發酵過程殘糖變化曲線Fig.1 Residue sugar content during the fermentation

表1為4個不同發酵酒樣的理化指標。F1、F2和F4酒樣的酒精度在11%～13%vol范圍內，各項理化指標值也較為相似，揮發酸含量介于0.4～0.7 g/L，符合葡萄酒對揮發酸含量的常規需求。而F3酒精度較低(9.07%)，揮發酸含量達0.81 g/L，接近引起不良風味的感官閾值(0.7～1.0 g/L)。所有酒樣甘油含量沒有顯著差異，均在4.75～5.55 g/L范圍內，也在葡萄酒中常見的甘油含量5～20 g/L范圍內。乙醛是影響葡萄酒風味的重要物質之一，紅葡萄酒中的含量通常介于40～80 mg/L。F2和F3酒樣中乙醛含量顯著高于F1和 F4，其中F3乙醛含量最高(69.37 mg/L)(表1)，但低于其風味閾值100～125 mg/L。

盡管F3的揮發酸、滴定酸較高，但該菌在混菌發酵(F4)中并沒有引起揮發酸總量的升高，這表明HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌發酵可以降低酒樣中揮發酸和總酸的含量，該結果與前期有關H.uvarum和S.cerevisiae混菌發酵降低揮發酸和總酸產量的研究結果一致[10]。

表1 不同發酵酒樣的理化指標Table 1 Final results of the fermentation with the indigenous yeast strains

2.2 發酵過程中酵母生長曲線

圖2為不同發酵過程的酵母生長曲線。商用活性干酵母FX10和HBKS-Y1的單菌發酵 (F1和F2)中S.cerevisiae的生長曲線沒有顯著差異(圖2-a)，S.cerevisiae的細胞數量均在發酵的第3天達到最大值(108CFU/mL)，直到發酵結束變化不大。而F4中的野生S.cerevisiae的細胞數量最大值未達到108CFU/mL(圖2-b)。文獻報道混菌發酵中的NSC會影響S.cerevisiae細胞的生長[5]，本文的研究結果驗證了這一影響作用 (圖2)。

F3和F4中HBKS-Y3的數量在發酵的第2天均達到最大值，分別為7.73×107和 7.48×107CFU/mL，之后開始下降(圖2-a)。圖2的數據同時說明野生HBKS-Y3單菌也能完成酒精發酵，與圖1數據結果一致。此結果與HONG等[11]的研究結果一致。但與ANDORR等[12]的研究結果不同。

a-單菌發酵;b-混菌發酵圖2 葡萄汁發酵過程中酵母細胞生長曲線Fig.2 Evolution of yeast population during Muscatjuice fermentation

F4發酵結束時，HBKS-Y3的數量遠低于F3。說明混菌發酵時大量存在的HBKS-Y1抑制了HBKS-Y3的生長[13]。據報道，對釀造環境例如高乙醇體積分數的低耐受性是導致混菌發酵過程中NSC死亡的主要原因之一[9]。但本研究中的混菌發酵早期，并沒有出現HBKS-Y3的大量死亡，說明在與HBKS-Y1混菌發酵的前4 d，HBKS-Y3生長情況良好，這一結果與BEZERRA-BUSSOLI等[14]有關H.uvarum-S.cerevisiae混菌發酵的研究結果一致。這表明，本研究中的HBKS-Y3具有較高的酒精耐受性。傳統觀點認為，混菌發酵中，直到酒精度達到4%～7%vol，NSC通常會以較高的濃度存在。然而，許多研究表明，接種H.uvarum進行混菌發酵，可以獲得高于7%酒精度[11,15]。以上結果說明，酒精并不是引起混菌發酵過程中NSC早期死亡的唯一因素。NISSEN等[16]的研究認為，高濃度的S.cerevisiae細胞似乎通過群體細胞感應引起NSC細胞的死亡。已有的一些研究發現，S.cerevisiae分泌的一些中、短鏈脂肪酸、蛋白質和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)以及酵母細胞間的群體效應也很有可能是導致混菌發酵體系中NSC細胞死亡的重要因素之一[12,17-18]。但目前對混菌發酵過程中S.cerevisiae與NSC交互作用的機制并不清晰，許多相關研究的結果存在著不一致的情況。說明S.cerevisiae與NSC交互作用存在種間和種內差異，同時也和接種策略及發酵條件有關。具體原因需要通過設計不同的接種策略、發酵條件、營養條件等試驗進一步確定。

2.3 揮發性成分分析

從4個酒樣中共檢測到包括酯類、高級醇、萜烯物質和酮類等在內的24種芳香成分，結果見表2。

2.3.1 酯類物質

發酵酯類物質對葡萄酒的水果香氣具有重大影響作用，尤其對年頭尚早的紅葡萄酒和白葡萄酒。表2給出了不同發酵酒樣中酯類物質的種類和濃度。F3和F4酒樣中具有較高含量的酯類物質，這一結果與前期有關H.uvarum和S.cerevisiae的研究結果一致[19]。據報道，H.uvarum具有較強的酯類物質分泌能力，可以與S.cerevisiae混菌發酵可以提高酒樣中酯類物質的含量，這也是近些年來H.uvarum越來越受關注的主要原因之一。

表2 不同發酵酒樣中的主要香氣成分Table 2 Aroma compounds identified in Muscat winesfrom different fermentations

注：“-”表示未檢測出

乙酸乙酯是葡萄酒中最主要的酯類物質之一，其閾值為150～200 mg/L，超過此值會使葡萄酒具有餿味。含量為80 mg/L左右時，賦予葡萄酒水果香味，同時可以增加葡萄酒的風味復雜性。Hanseniaspora屬的酵母被認為是一種優良的酯類物質生產菌，通常會引起高含量的乙酸乙酯[20]，本文結果證實了這一點。本研究中HBKS-Y3發酵(F3)酒樣中乙酸乙酯的含量顯著高于其他酒樣。而HBKS-Y3和HBKS-Y1發酵(F4)酒樣中，乙酸乙酯的含量顯著降低。F3酒樣中乙酸乙酯的含量為 95.507 mg/L，分別比F1和F2高10.348和5.189倍，而僅比F4酒樣高2.070倍。這表明混菌發酵中S.cerevisiae細胞的存在抑制了H.uvarum對酯類物質的代謝。在先前的一些混菌發酵研究中也發現了類似的交互影響作用[19-20]。

丁酸乙烯酯、己酸烯丙酯和2-氧環戊基乙酸乙酯是F2酒樣中主要的酯類物質，但在F3中這些酯類物質的含量較低，而F4酒樣中沒有檢測到氧環戊乙酸乙酯。HERRAIZ等[21]研究發現S.cerevisiae是這些酯的強生產菌，接種尖端酵母H.uvarum可使這些酯減少。而表2數據表明，除己酸烯丙酯外，商用S.cerevisiae(FX10)對丁酸乙烯酯、2-氧環戊基乙酸乙酯并沒有表現出強的生產能力(F1)。推測認為，S.cerevisiae對這些酯的生產能力存在種內差異。

2.3.2 高級醇

4種發酵中，尤其是有HBKS-Y3參與(F3或F4)的發酵與有S.cerevisiae參與(F1、F2和F4)的發酵中高級醇的種類和含量顯著不同。F1與F2中分別檢測到5和6種高級醇。而F3和F4中分別只檢測到4種高級醇。只在F2中檢測到了十二烷醇和2-甲基-丁醇，而環己-2-烯-1-醇只在S.cerevisiae參與(F1和F2)的發酵中檢測到。在所有酒樣中均檢測到了異戊醇和2-苯乙醇，但含量顯著不同。異戊醇是葡萄酒中最重要的高級醇，具有獨特的刺鼻氣味，在葡萄酒中的濃度通常在90～300 mg/L之間。高濃度的異戊醇對葡萄酒風味有不利影響，低濃度對葡萄酒風味有積極影響。本研究中，F1酒樣中異戊醇的含量明顯高于其他發酵酒樣，而F3中異戊醇的含量最低。

2-苯乙醇是葡萄中苯丙酸代謝的衍生物，具有玫瑰般的花香，是麝香葡萄酒特征香氣成分之一。在本研究中，F4中2-苯乙醇含量最高，F1次之。HBKS-Y1單菌發酵酒(F2)中的2-苯乙醇的含量最低，但與HBKS-Y3混菌發酵后(F4)，2-苯乙醇的含量分別比單菌發酵(F2和F3)增加了1.83和0.68倍。由此可見，HBKS-Y1與HBKS-Y3混菌發酵有利于突出玫瑰香葡萄酒的特征香氣。

高級醇具有強烈而刺鼻的氣味，對葡萄酒的味道和品質有重要的影響。高濃度或低濃度的高級醇會對葡萄酒的風味產生不利影響。含量過少會使葡萄酒的風味淡??；含量過多會給人以辛辣、腐臭感和不悅的苦澀味。另外，高級醇含量過多還對人體有麻醉作用或使飲用者中毒。因此，有必要降低葡萄酒中的高級醇含量以改善葡萄酒的風味。在本研究中，高級醇的含量大約在108～223 mg/L范圍內，這個含量范圍的高級醇通常在葡萄酒中廣泛存在。在4個發酵酒中，F3高級醇總量最低，F2最高。文獻報道表明，與S.cerevisiae單菌發酵相比，尖端酵母單菌發酵及其與S.cerevisiae混菌發酵的高級醇量均有所降低[15,20]。本研究的結果與以上文獻不太一致，HBKS-Y3單菌發酵高級醇含量最高，此HBKS-Y1混菌后高級醇含量降低了10.04%。

2.3.3 萜烯類物質

萜類物質具有強烈的芳香氣味，且閾值較低，是玫瑰香葡萄和玫瑰香葡萄酒中的典型香氣成分。此外，單萜醇類物質例如芳樟醇(里哪醇)、香茅醇、香葉醇和橙花醇是玫瑰香葡萄中含量最豐富的典型香氣成分。表2結果表明，4個發酵酒中共發現9種萜類化合物，其中芳樟醇(里哪醇)和松油醇含量均顯著高于其他萜類化合物。它們是麝香葡萄果肉和果皮中的主要成分，對該葡萄品種的典型花香和葡萄酒的典型果香起重要作用。本文檢測到F4中萜類物質總量(736.09 μg/L)和單萜醇物質總量(584.05 μg/L)均為最高，F1兩種物質總量次之 (632.24和370.59 μg/L)，而F3最低(470.22和332.09 μg/L)。

MENDES-FERREIRA等[22]的研究表明，Kloeckeraapiculata(科勒克尖端酵母，無性型為H.uvarum) 能夠釋放萜類物質。本文的研究表明， HBKS-Y3單菌發酵萜類物質含量相對降低(F3)，但其與HBKS-Y1混菌發酵萜類物質含量大大增加(F4)，表明混菌發酵過程中HBKS-Y3和HBKS-Y1之間產生了某種交互作用，增加了葡萄汁或者葡萄皮中萜類物質的釋放，或者增加了科勒克尖端酵母釋放萜類物質的量。葡萄皮中萜類化合物(單萜)的含量遠高于葡萄汁中萜類化合物的含量[23]。因此，盡可能多地將葡萄皮中的結合態糖苷釋放到葡萄汁中，結合酶的水解作用，將有助于改善葡萄酒的香氣。

以上的研究結果表明，本土酵母發酵尤其是混菌發酵，在玫瑰香葡萄酒增香方面具有一定的優勢，可以增加玫瑰香葡萄特征香氣的含量，例如2-苯乙醇、單萜醇等。

2.4 感官分析

圖3是4種酒樣的感官評定結果。F1和F4的總接受度得分最高，但F4的花香和玫瑰香得分最高，F1次之。PIETROWSKI等[24]的報告表明S.cerevisiae與Hanseniaspora屬酵母混菌發酵對提高蘋果酒的花香有積極作用。本文HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌發酵也得到類似的結果。證實了前人有關Hanseniaspora屬和S.cerevisiae混菌發酵對葡萄酒風味的積極作用。此外本結果表明，HBKS-Y3單菌發酵 (F2)的花香并不突出，而且酸度過于突出，總接受度低。說明該野生NSC單菌發酵特性較差，更適合用于與S.cerevisiae混菌發酵。

圖3 不同發酵酒樣的感官評價Fig.3 Results of the sensory analysis of Muscat winesfrom different fermentations

3 結論

本試驗對分離自玫瑰香葡萄自然發酵過程中的野生S.cerevisiae(HBKS-Y1)和野生H.uvarum(HBKS-Y3)的混菌發酵過程及其對玫瑰香葡萄酒香氣的影響進行了分析。發現2株野生酵母單菌及混菌時均能單獨完成發酵，但對葡萄酒的理化指標、香氣成分和感官影響不同。HBKS-Y3單菌發酵，酒精度低，揮發酸含量高，乙酸乙酯含量也較高，感官評價得分最低；混菌發酵時HBKS-Y1和HBKS-Y3存在交互作用，使HBKS-Y1高級醇產量降低，同時抑制了HBKS-Y3的產酯和產酸能力，更重要的是兩者混菌發酵提高了玫瑰香葡萄酒典型特征香氣成分2-苯乙醇、萜烯類物質及單萜醇的含量。此外，混菌發酵酒樣感官評定總接受度與商用釀酒酵母FX10相當，但花香和玫瑰香香氣得分更高，感官評定結果和香氣成分分析具有一致性。以上結果說明，HBKS-Y1和HBKS-Y3的混菌發酵有利于突出玫瑰香葡萄酒的品種香氣特征。