七葉皂苷鈉抑制大鼠晶狀體組織氧化損傷的實驗研究

李雅琢，徐甄，蘭天野，張議文，張麗娟，劉平

七葉皂苷鈉(sodium aescinate)因其具有較強的抗氧化、抗炎、改善微循環作用而用于各種腦缺血性疾病的治療[1]。然而，國內外關于七葉皂苷鈉對大鼠晶狀體保護作用的研究卻很少，但是有研究發現七葉皂苷鈉高劑量處理組可以抑制晶狀體上皮細胞內NF-κB 的活化表達，抑制通過紫外線照射方法誘導離體大鼠晶狀體發生白內障[2]。本研究將七葉皂苷鈉作用于氧化損傷誘導的白內障大鼠晶狀體，觀察該藥物對晶狀體組織透明度、晶狀體上皮細胞形態、晶狀體組織內還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力及NF-κB 蛋白表達的影響，以期為臨床白內治療障提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

七葉皂苷鈉 (購于武漢普生制藥有限公司)，NF-κB 抗體(上海碧云天公司)，還原性谷胱甘肽（GSH）及過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工司），蘇木素-伊紅染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)，手術顯微鏡(德國Leica)，BCA 蛋白測定試劑盒、PVDF 膜及化學發光試劑(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 晶狀體分離及培養 清潔級健康雄性4 周齡Sprague-Dawley 大 鼠40 只，體質量(160±20) g，購自哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物研究中心。脫臼后，在解剖顯微鏡下無菌操作取兩只眼睛，用生理鹽水、青霉素(80 萬U/500 mL)和慶大霉素(8 萬U/500 mL)沖洗3 次后，在顯微鏡下分離晶狀體組織，置入含有1.5 mL M199 的24 孔培養板中，每孔1 只晶狀體。

1.2.2 實驗分組 按照隨機數字法將晶狀體分為4組，每組20 只晶狀體?？瞻讓φ战M：單純M199 培養基培養；七葉皂苷鈉組：M199 培養基內七葉皂苷鈉濃度為0.2 g/L；氧化損傷組：培養基內H2O2濃度為1 mmol/L；氧化損傷+七葉皂苷鈉組：培養基內H2O2濃度為1 mmol/L，七葉皂苷鈉濃度為0.2 g/L，分別培養6 h、12 h、24 h 后取相應時間點晶狀體觀察并實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1 晶狀體透明度觀察記錄方法 取上述各時間點的各組晶狀體觀察透明度。在白色背景下設計粗細一致的十字交叉黑色線條，將被檢晶狀體置于十字交叉處，以透過晶狀體所能看到的清晰度予以分級?！?”：晶狀體透明，線條清晰可見；“+”：線條增粗，模糊，但是完全可見；“++”：僅晶狀體中央部隱約可見線條輪廓；對“+”的數量行統計學處理。

1.3.2 HE 染色 晶狀體觀察透明度后，每組隨機取10 只晶狀體迅速浸入新鮮配制的多聚甲醛（40 g/L）中固定40 min，制備石蠟切片，用蘇木素染色5 min，蒸餾水洗滌，去玻片的浮色，置于1%鹽酸乙醇中浸泡10 s 后伊紅染色5 min，再用蒸餾水洗滌以除去浮色。

1.3.3 透射電鏡2.5%戊二醛溶液固定晶狀體24 h，醋酸鈾染液染色，丙酮脫水，常規電鏡包埋，制作超薄切片，枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察（×10000）。

1.3.4 GSH 含量及CAT 活力測定 取適量晶狀體組織制成勻漿，3000 r/min 離心15 min，去上清液置于EP 管內，按照試劑盒說明，采用ELISA 法測定GSH含量及CAT 活力。

1.3.5 Western blot 檢測 將每組剩余的10 只晶狀體以RIPA 裂解液提取總蛋白后，用BCA 蛋白質測定試劑盒測定濃度，電泳分離蛋白及轉膜后分別加入一抗、二抗，采用增強化學發光法曝光顯影并掃描灰度。

1.4 統計學方法

采用SPSS16.0 統計學軟件對實驗數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組晶狀體透明度情況

空白對照組及七葉皂苷鈉組透過晶狀體可以清晰看到下方的十字線，氧化損傷組晶狀體透明度明顯下降，晶狀體下方的十字線變得模糊。與空白對照組比較，氧化損傷組在6 h（χ2=4.970，P=0.043），12 h（χ2=7.619，P=0.006）及24 h（χ2=5.714，P=0.017）時間點上均有統計學意義（P＜0.05）；與七葉皂苷鈉組比較，氧化損傷組在6 h（χ2=4.803，P=0.028），12 h（χ2=6.144，P=0.013）及24 h（χ2=4.444，P=0.035）時間點上也均有統計學意義（P＜0.05）；而氧化損傷+七葉皂苷鈉組晶狀體混濁情況明顯輕于氧化損傷組，與氧化損傷組比較，12 h （χ2=4.800，P=0.028） 及24 h（χ2=4.444，P=0.035）時間點上差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖1，表1）。

表1 各組晶狀體混濁數量比較（n=20）

2.2 HE 染色情況

空白對照組及七葉皂苷鈉組晶狀體上皮細胞為單層立方形細胞，排列整齊。而氧化損傷組晶狀體邊緣不規則，晶狀體上皮細胞大小不一，細胞排列紊亂，近赤道部尤其明顯，給予七葉皂苷鈉干預后，細胞形態逐漸規則（圖2）。

2.3 電鏡觀察大鼠晶狀體

透射電鏡觀察顯示，空白對照組及七葉皂苷鈉組大鼠晶狀體上皮細胞胞膜結構完整，細胞核膜連續，染色質均勻，核仁結構清晰；氧化損傷組晶狀體上皮細胞基質密度減低，胞質內空泡形成，細胞核腫脹，染色質稀疏；給予七葉皂苷鈉干預后，細胞形態逐漸改善，細胞內仍可見線粒體空泡樣改變，細胞核形態略規整（圖3）。

圖1 各組晶狀體透明度觀察。1A 空白對照組；1B 七葉皂苷鈉組；1C 氧化損傷組；1D 氧化損傷+七葉皂苷鈉組

圖2 HE 染色觀察近赤道部大鼠晶狀體前膜囊及晶狀體上皮細胞(×40)。2A 空白對照組；2B 七葉皂苷鈉組；2C 氧化損傷組；2D 氧化損傷+七葉皂苷鈉組

圖3 透射電鏡觀察大鼠晶狀體（×10000）。3A 空白對照組；3B 七葉皂苷鈉組；3C 氧化損傷組；3D 氧化損傷+七葉皂苷鈉組?！骱四?；* 染色質；# 空泡

2.4 晶狀體組織中GSH 含量及CAT 活力變化

GSH 含量：氧化損傷組與空白對照組比較，t=12.024，P=0.000；與七葉皂苷鈉組比較，t=15.240，P=0.000；與氧化損傷+七葉皂苷鈉組比較，t=5.573，P=0.005，均有統計學意義。

CAT 活力：氧化損傷組與空白對照組比較，t=9.461，P=0.000；與七葉皂苷鈉組比較，t=9.482，P=0.000；與氧化損傷+七葉皂苷鈉組比較，t=4.118，P=0.015，均有統計學意義（表2）。

表2 晶狀體組織GSH 含量、CAT 活力及NF-κB 蛋白相對表達量變化

2.5 Western-blot 檢測晶狀體上皮細胞內NF-κB 表達的影響

氧化損傷組大鼠晶狀體中NF-κB 的蛋白表達量顯著高于空白對照組及七葉皂苷鈉組（t空白=5.175，P空白=0.007；t七葉皂苷=3.924，P七葉皂苷=0.017）；氧化損傷+七葉皂苷鈉組大鼠晶狀體中NF-κB 的蛋白表達量降低，與氧化損傷組比較差異有統計學意義（t=3.571，P=0.023）（表2，圖4）。

3 討論

圖4 Western-blot 檢測晶狀體上皮細胞內NF-κB 蛋白表達。NFκB：核因子κB；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

氧化應激參與人體許多衰老疾病的發生，如阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、帕金森病等，另外，許多視力損害和致盲疾病也與氧化應激有關，如青光眼、白內障、視網膜病變等[3-4]。其中，白內障的發生率在致盲性眼病中最高，有效的防治藥物仍然是最理想的治療選擇。國內外已有許多實驗和流行病學研究建議可以通過使用抗氧化劑和某些代謝受體激動劑延緩白內障的發生[5-6]。

七葉皂苷鈉主要成分為三萜皂苷，臨床上多用于缺血性腦病及腦水腫的治療[7-8]。近年來，逐漸有學者將七葉皂苷鈉引入到眼科疾病的治療中[9-10]。本課題旨在探討七葉皂苷鈉在氧自由基導致的晶狀體上皮細胞凋亡中的作用，從而進一步拓寬七葉皂苷鈉的臨床應用。

為了研究白內障病變的發生機理并探索出更多的治療性藥物，國內外學者嘗試了大量方法誘導晶狀體組織凋亡，例如：化學藥物、紫外線照射、H2O2等[11-12]。本實驗中，我們參考既往學者制備過氧化氫誘導鼠白內障方法，建立大鼠白內障模型，觀查七葉皂苷鈉對晶狀體上皮細胞的保護作用[2，13]。晶狀體形態學觀察結果顯示，氧化損傷組晶狀體透明度明顯下降，七葉皂苷鈉作用后，晶狀體透明度提高，表明七葉皂苷鈉的干預對維持晶狀體透明度有保護作用。此外，HE 染色顯示氧化損傷組晶狀體囊皺縮，晶狀體上皮細胞紊亂，這可能是由于H2O2刺激后影響了晶狀體內離子通道的正常功能，晶狀體的代謝及防御功能出現紊亂，導致晶狀體前囊膜受損，從而誘導了晶狀體的混濁。

晶狀體組織氧化損傷后會產生一系列的病理改變，產生大量自由基，自由基通過信號轉導途徑引發脂質過氧化連鎖反應，從而導致GSH 及CAT 等抗氧化酶清除自由基的能力降低，導致晶狀體混濁進一步加重。本研究結果顯示，氧化損傷組GSH 含量和CAT 活力明顯低于空白對照組及七葉皂苷鈉組，說明氧化損傷組晶狀體組織氧化損傷程度較重，七葉皂苷鈉處理后GSH 含量和CAT 活力均升高，表明七葉皂苷鈉具有抑制脂質過氧化連鎖反應的能力，進一步抑制了晶狀體損傷的發生。

NF-κB 屬腫瘤壞死因子受體超家族的一員，參與炎癥反應和免疫應答反應，可以對有害細胞的刺激做出反應，許多分子都受NF-κB 的調控[14]。我們的研究結果顯示，高濃度H2O2誘導了晶狀體上皮細胞內NF-κB 水平升高，七葉皂苷鈉有效降低NF-κB 表達水平，進一步證實七葉皂苷鈉可抑制氧化損傷誘導的晶狀體上皮細胞凋亡。

七葉皂苷鈉的細胞毒性被公認為低于化學合成藥物，被廣泛用于多種全身疾病的治療，鑒于其臨床應用的有效性及安全性，我們考慮，七葉皂苷鈉有望成為治療白內障的有效藥物，為該病的臨床治療提供新思路。