越南油茶脂肪酸積累及相關基因表達動態分析

郭鈺柬,王 紅,周開兵,王珮璇,楊成坤,陳 靜

(海南大學熱帶作物新品種選育教育部工程研究中心，海南 ?？?570228)

目前，國內主要栽培的油茶種包括普通油茶(CamelliaoleiferaAbel.)、小果油茶(CamelliameiocarpaHu)和越南油茶(CamelliavietnamensisT. C. Huang ex Hu)，其中，越南油茶是栽培面積最小、總產量最低、最具地域特色的樹種。越南油茶又稱為高州油茶、陸川油茶、華南油茶和大果油茶等。海南省現存40年生以上的老油茶林或零星單株都是越南油茶[1]，其栽培歷史悠久，所產茶籽油的口感與品質也有別于內地[2]，富含脂肪酸種類豐富，營養價值高[3]，且價格是內地油茶的3～4倍，因此越南油茶茶籽油是海南省地域特色和市場競爭優勢明顯、經濟價值極高的重要林產品。茶籽油脂肪酸組成是影響其營養和醫療保健價值的重要因素[4-6]，因而有必要開展越南油茶茶籽油脂肪酸積累的動態變化特點及其分子機理等問題的研究。

有關普通油茶茶籽油脂肪酸積累過程的動態變化研究較多。在湖南省林業科學研究院油茶種質資源基地，以無性系油茶“湘林78號、湘林11號”種子為試驗材料，觀測到的脂肪酸主要以不飽和脂肪酸為主，油酸含量最高，其次是亞油酸；飽和脂肪酸以棕櫚酸和硬脂酸為主；其中油酸呈明顯上升趨勢，棕櫚酸和亞油酸呈明顯下降趨勢，硬脂酸呈小幅上升趨勢，亞麻酸呈小幅下降趨勢[7]。在浙江省金華市東方紅試驗林場油茶良種試驗林，以10年生優質無性系“長林4號、長林40號和長林166號”油茶種子為試驗材料，觀測到各月份脂肪酸組成差異很大；油酸含量隨著種子成熟迅速增加，成熟時占脂肪酸總量的80%；其次為亞油酸，7月份含量較高，但隨著種子成熟迅速減少；亞麻酸和棕櫚酸都隨著種子成熟而降低；硬脂酸含量較低，逐月含量細微升高；棕櫚烯酸和順-11-二十碳烯酸各時期含量都處于較低水平[8]。在玉屏縣茅坡油茶試驗站，以15年生油茶種子為試驗材料，觀測到在8月下旬到9月中旬種仁含油率快速上升，棕櫚酸和花生酸的消減強度都是隨著種仁的成熟而降低，在整個生長發育過程中油脂都含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和花生酸[9]。筆者課題組對越南油茶成熟種子的茶籽油脂肪酸組成和不同脂肪酸之間的轉化關系已經作過一些研究[10-11]，但關于越南油茶茶籽油脂肪酸積累的動態變化特點等問題則尚未見報道。

前人對包括普通油茶在內的油料植物研究表明△9硬脂酰-ACP脫飽和酶(SAD)是硬脂酸去飽和生成油酸的關鍵酶，脂肪酸脫飽和酶2(FAD2)催化油酸脫氫生成亞油酸，脂肪酸脫飽和酶3(FAD3)是調控亞油酸經催化生成亞麻酸的關鍵酶，脂肪酸延長酶1(FAE1)調控油酸到花生烯酸的轉化[12-14]。因此本文對越南油茶茶籽油在種子生長發育過程中不同脂肪酸含量其關鍵酶如SAD、FAD2、FAD3和FAE1等的編碼基因表達量作動態變化研究，以期初步揭示越南油茶茶籽油脂肪酸積累的分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地概況 油茶園位于海南省澄邁縣福山鎮長安村，于2003年采用越南油茶實生苗建園，采用常規管理方法管理，2018年全年未遭遇光、熱、水災害。油茶林地處熱帶季風及海洋濕潤氣候區，年平均氣溫24 ℃，年平均降雨量2 250 mm，年均日照時間1 900 h，終年無霜雪。該園土壤為磚紅壤，土壤有機質豐富，富含鉀和硒等元素。主要物候期：上一年12月—翌年1月為盛花期，2—4月為末花期和坐果期，5—9月為果實迅速膨大期和花芽分化期，10 —11月為果實成熟期。

1.1.2 試驗材料 2018年3月，在油茶園內選株產鮮果10 kg以上的健壯單株4株作為試驗樹，命名編號為HC1、HC2、HC3和HC4，自4月5日坐果后開始取果樣，在樹冠外圍中部四方隨機選取大小中等的5個果實掛牌，標記為以后采樣的大小參照標準果，此后至10月5日每隔1個月取樣 1 次，在10月下旬果實采收期加采1次，采樣日期分別為4月13日、5月8日、6月5日、7月5日、8月5日、9月5日、10月5日、10月24日。每次在每棵樹樹冠外圍中部采果10個，按照不同單株分裝，液氮速凍并帶回實驗室，之后置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。因果實8月份才開始硬核，故茶籽油自8月份樣品開始提取制備。

1.2 茶籽油提取和脂肪酸含量的測定方法

將干種仁研磨成粉并隨機挑取2～5 g稱重，以石油醚作提取劑，采取索氏提取法制備。按照國家標準GB/T 17376—2008《動植物油脂脂肪酸甲酯制備》[15]的要求制備脂肪酸甲酯。采用劉歡等[10]的氣相色譜法檢測脂肪酸種類及其含量?；旌蠘藰影珻12～C24脂肪酸甲酯，標樣組成見表1。

表1 脂肪酸甲酯混合標樣組成Table1 The composition of the mixed standard fatty acid methyl ester sample

1.3 種仁總RNA的提取和酶基因熒光定量PCR分析

取1粒油茶種仁在液氮中研磨至粉末，稱取150 mg粉末立即加入1 mL Trizol，充分混勻裂解；加入200 μL 氯仿，用力充分振蕩混勻， 4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取上清，加入等體積酚仿，充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心 10 min；取上清，加入等體積氯仿，充分振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min；取上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，-20 ℃ 沉淀1 h。4 ℃ 12 000 r·min-1離心 15 min；棄上清，加0.5 mL 75%乙醇，4 ℃ 8 000～10 000 r·min-15 min；重復上一步驟；棄上清后短暫離心，移液槍吸干乙醇，真空干燥2 min；加20 μL RNA-Free water，室溫溶解5 min，混勻后短暫離心得到RNA溶液。電泳檢測提取RNA的完整性，NANODROP RNA質量檢測儀測定RNA濃度。OD值：A260/A280=1.7～2.1；A260/A230=1.7～2.0，樣品濃度≥200 ng·μL-1，樣品總量≥2.5μg。

根據已有的普通油茶SAD和FAD2基因序列保守區(GenBank 登錄號 KJ995982.1，KJ995981.1)及內參基因actin(GenBank 登錄號 KC337044.1),參考相關文獻[16-17]及轉錄組測序數據利用同源比對，篩選出越南油茶SAD和FAD2基因序列，利用Primer 5進行引物設計；FAD3和FAE1引物則參照相關文獻[12]，引物序列見表2。將所提取的RNA按照FastQuant RT Kit (with gDNase)說明書合成cDNA，使用ABI step one plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司)推薦程序進行熒光定量PCR實驗，具體程序為：95 ℃預變性90 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃退火20 s，40個循環，每個反應重復3次。采用2-△△Ct方法分析目的基因相對表達量；采用Excel軟件繪制脂肪酸組分和相對含量及相關基因相對表達量的折線分析圖。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 數據處理

采用SAS軟件ANOVA過程作方差分析，采用Duncan法對不同時期脂肪酸含量和基因相對表達量作多重比較分析；采用CANCORR過程對不同時期脂肪酸相對含量和關鍵酶編碼基因相對表達量作典型性相關分析；采用CORR過程對不同時期脂肪酸相對含量、基因相對表達量等相互間作多元線性相關分析(只求偏向關系式)，各變量與脂肪酸含量和基因表達量對應關系見表3。

2 結果與分析

2.1 種子發育過程中脂肪酸含量的動態變化

表3 兩組變量分別與基因表達量和脂肪酸含量的對照表Table 3 Comparison table of the two groups of variables and the contents of FA and the expression of genes respectively

2.1.1 飽和脂肪酸 圖1為種子發育過程中飽和脂肪酸組分及含量的動態變化。從茶籽油中共檢測出7種飽和脂肪酸，其中以棕櫚酸和硬脂酸為主；棕櫚酸相對含量整體呈下降趨勢，以8月5日最高，以10月5日和10月24日最低，9月5日居中且與最高、最低含量無顯著差異；硬脂酸相對含量總體呈與棕櫚酸相對含量相反的上升趨勢，以8月5日和9月5日最低，以10月24日最高，10月5日居中且與最高、最低含量無顯著差異；肉豆蔻酸和花生酸含量在各時期差異不顯著；月桂酸、山崳酸、木焦油酸等3種飽和脂肪酸在越南油茶中都是首次發現，且所占比重極小，各時期脂肪酸相對含量差異不顯著?？傊?，越南油茶茶籽油主要飽和脂肪酸含量在不同時期差異顯著，且在脂肪酸轉化過程中可能存在棕櫚酸向硬脂酸的直接轉化。

2.1.2 高含量不飽和脂肪酸 油酸和亞油酸是越南油茶茶籽油的2種含量較高的不飽和脂肪酸，其動態變化如圖2所示。油酸含量極顯著高于亞油酸含量；油酸相對含量以9月5日和10月5日顯著最高，以8月5日顯著最低，10月24日居中且與最高、最低含量無顯著差異；亞油酸相對含量在8月5日顯著高于其它時期?？梢?，8月5日到9月5日是油酸快速積累時期，油酸的積累隨著種子的成熟而增加，亞油酸的積累隨著種子的成熟而減少。

2.1.3 低含量不飽和脂肪酸 越南油茶茶籽油中還檢測出6種低含量不飽和脂肪酸，其含量動態變化如圖3所示。亞麻酸相對含量呈下降趨勢，以8月5日最高，9月5日次之，10月24日最低，且差異顯著；10月5日與9月5日和10月24日均無顯著差異，但其與8月5日差異顯著。棕櫚油酸相對含量呈下降趨勢，且在8月5日顯著高于其他時期?；ㄉ幌┧嵯鄬吭诟鲿r期差異不顯著?；ㄉ┧?、芥酸和二十四碳一烯酸等3種脂肪酸在越南油茶中都是首次發現，其中花生二烯酸和芥酸相對含量在各時期差異不顯著，而二十四碳一烯酸僅在10月24日油茶油樣品中發現?？梢?，越南油茶茶籽油不飽和脂肪酸種類較多，其有可能提升茶籽油營養價值，且不同的低含量不飽和脂肪酸具備不同的積累特點。

2.1.4 飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的轉化 由圖2還可見，油酸和亞油酸含量動態變化呈極顯著線性負相關(R2=0.934 9，P<0.000 1)，說明在脂肪酸積累過程中可能存在油酸向亞油酸的轉化，油酸積累增加可能與其向亞油酸轉化受抑制有關。由圖4可見，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量動態變化也存在極顯著負相關關系(R2=1，P<0.000 1)，說明可能存在飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的轉化，并且選擇合適的采果日期應該是提高茶籽油不飽和脂肪酸比例的有效手段之一。

2.2 種子發育過程中脂肪酸轉化相關基因的表達分析

由圖5可見，SAD基因相對表達量呈現先上升后緩慢下降的趨勢，以8月5日顯著最低，以9月5日顯著最高，10月5日和10月24日居中且與最高、最低表達量無顯著差異；FAD2基因相對表達量呈上升趨勢，且8月5日顯著低于其他各時期；FAD3 和FAE1等的基因的相對表達量在各時期無顯著異?？梢?，SAD基因相對表達量與油酸相對含量的動態變化趨勢一致；FAD2基因相對表達量和亞油酸相對含量動態變化在8月5日—9月5日呈相反趨勢，此后與亞油酸含量動態變化一致，即再無顯著變化。FAD3基因相對表達量一直處于較低水平且各時期差異不顯著，這與亞麻酸含量較低和與其動態變化趨勢一致；FAE1基因相對表達量各時期無顯著差異，也與花生一烯酸相對含量動態變化趨勢一致。說明不同脂肪酸的積累特點與控制其轉化的關鍵酶基因表達效率動態變化特點基本一致。

2.3 典型性相關分析

對4種關鍵酶基因相對表達量與5種相關的脂肪酸含量作典型性相關分析，得到4對典型性相關變量，但只有第一對典型性相關變量呈極顯著相關(P=0.002 9)，說明典型性相關分析效果極其理想，典型性相關變量如下：

日期 Date

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不帶字母表示相互間差異不顯著(P≥0.05)。Note:the different letters show the extremely significant difference atP<0.05,and no letters show the insignificant difference atP≥0.05.

圖3 低含量不飽和脂肪酸組分及含量的動態變化
Figure 3 Dynamic changes of low content unsaturated fatty acid composition and content during seed development

圖4 飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量的動態變化
Figure 4 Dynamic changes of saturated fatty acid and unsaturated fatty acid content during seed development

日期 Date

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不帶字母表示相互間差異不顯著(P≥0.05)。Note:the different letters show the extremely significant difference atP<0.05,and no letters show the insignificant difference atP≥0.05.

圖5 不同時期脂肪酸合成相關基因相對表達量
Figure 5 Relative expression of genes related to fatty acid

U=-2.181 8x1+2.000 1x2+0.511 4x3+0.130 6x4

(1)

V=0.736 2y1-0.063 8y2+0.554 6y3-0.358 1y4-0.429 2y5

(2)

各變量與典型性相關變量之間的相關系數如表4，可見，主要是x2(FAD2基因相對表達量)、x3(FAD3基因相對表達)、x4(FAE1基因相對表達)與y1(硬脂酸含量)、y4(亞麻酸含量)、y5(花生一烯酸含量)的相關性，說明這些關鍵酶基因的表達效率可能受最開始的底物和最終的生成物的積累所調節，并反過來決定原始底物和最終產物的積累水平。

表4 各變量與典型性相關變量之間的相關系數Table 4 Correlation coefficients between variables and typical related variables

2.4 多元線性相關性分析

對4種關鍵酶基因相對表達量與5種相關的脂肪酸含量作典型性相關分析，其中具有顯著性的偏相關系數如表5所示。SAD基因相對表達量與硬脂酸含量呈負相關，而SAD是催化硬脂酸向油酸轉化的關鍵酶，說明SAD基因表達效率提高促進硬脂酸向油酸轉化而導致硬脂酸含量降低；FAD2基因相對表達量和硬脂酸含量呈正相關，說明硬脂酸積累對FAD2基因表達可能存在正調控作用；SAD與FAD2、FAD3基因相對表達量均呈正相關，FAD2是催化油酸向亞油酸轉化的關鍵酶，FAD3是催化亞油酸向亞麻酸轉化的關鍵酶，圖6顯示FAD2基因相對表達量很高，這造成油酸向亞油酸的轉化速率很高，說明SAD基因通過正調控作用促進FAD2和FAD3基因表達，進而促進硬脂酸向油酸、油酸向亞油酸和亞油酸向亞麻酸的一系列轉化，這也與表5結果所顯示的油酸與亞油酸含量間呈負相關一致；亞油酸含量與FAD3基因相對表達量呈正相關，說明亞油酸積累對FAD3基因表達具正調控作用。

表5 有顯著相關性的兩個變量之間的偏相關系數Table 5 Partial correlation coefficients between two variables with significant correlation

3 討論

前人在越南油茶茶籽油脂肪酸組分的研究上一般只檢測出5～7種脂肪酸[11,18]，而本文共檢測出15種脂肪酸酸，除主要成分如油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸等外，多出了一些有益于人體健康的不飽和脂肪酸。前人研究結果表明不同方法提取茶籽油對脂肪酸組成沒有顯著影響[19-22]，所以推測可能是不同產地導致的，這意味著海南省越南油茶茶籽油營養更加豐富。其中油酸是衡量食用油品質的重要指標[23]，具有降低血脂水平和預防心血管疾病的作用，是人和哺乳動物生長發育所必需的一種脂肪酸[24]。亞油酸與亞麻酸都屬于人和動物生長所必需的不飽和酸，在體內不能合成，必須在食物中獲取，其中亞油酸具有降低血清LDL-C水平的作用[24]。另外所測得的油茶籽油中，月桂酸、山崳酸、芥酸、木焦油酸、肉豆蔻酸、二十四碳一烯酸等對人體有害的脂肪酸含量均遠低于《油茶籽油》(GB/T11765—2018)國家質量標準。因此，海南產區的越南油茶茶籽油是具有鮮明地方特色的高品質食用油。

研究結果表明，8月5日到9月5日是油酸積累的關鍵時期，而亞油酸相對含量在8月5日之后呈下降趨勢，由于7月5日未從種子中提取出油脂，所以推測海南越南油茶亞油酸合成高峰期應在7月5日至8月5日之間，這與前人在普通油茶上的研究結果一致[8]。本文研究結果還表明油酸和亞油酸、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸等之間可能存在前者向后者的轉化關系，這與前人研究結果一致[25]；其中油酸和亞油酸存在此消彼長的關系，說明可能存在亞油酸向油酸轉化，其內在聯系需要進一步研究。并且油茶不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例在10月5日達到最大值，說明選擇合適的采果日期是提高油茶油不飽和脂肪酸比例的有效手段之一，這為不同越南油茶產區確定合理的采收時間提供了一定的科學參考。

核桃主要不同脂肪酸相互轉化模式圖如圖6所示[26]，說明這3種酶影響著底物(硬脂酸)和產物(亞麻酸和花生一烯酸)之間的關系，底物含量越多則會促進整個反應的進行，并且整個反應的相關酶基因表達量越高，本文結果表明硬脂酸含量與典型性相關變量U和V的相關系數均最大，說明底物對整個反應過程影響最大，取得與此一致的結果。

圖6 核桃主要不同脂肪酸相互轉化模式圖
Figure 6 Mutual transformation pattern of different fatty acids in walnutss

SAD基因是催化飽和脂肪酸第一步去飽和生成油酸的關鍵基因[27]，決定著C18以上不飽和脂肪酸的總含量及油脂中飽和與不飽和脂肪酸的比例[12]；本研究結果表明，8至9月SAD基因相對表達量迅速上升，SAD基因相對表達量與硬脂酸含量呈顯著負相關，硬脂酸積累和SAD基因表達均對FAD2基因表達具備正調控作用，其原因可能是，SAD基因上調表達促進油酸的積累增多而導致硬脂酸積累減少，有可能推進下游反應的進行，從而促進下游基因FAD2相對表達量升高。FAD2基因持續高表達但和亞油酸相對含量動態變化呈相反趨勢，這可能是由于亞油酸中的一部分轉化為亞麻酸導致的，事實上表明亞油酸積累會促進FAD3基因表達增強。本文結果還表明亞麻酸相對含量與FAD3基因相對表達量動態變化趨勢不符，這可能是由于FAD3基因的拷貝數目多個[28]，且油脂中油酸的合成速率要遠遠大于油酸轉化為亞油酸的速率，亞麻酸的轉化速率也因此受到影響，因此有關FAD基因家族對越南油茶脂肪酸的調控機制還需進一步研究?；诖?，SAD基因表達增強促進硬脂酸向油酸轉化，硬脂酸含量對FAD2基因表達、亞油酸含量對FAD3基因表達、SAD基因表達對FAD2基因表達等均表現正調控作用，這初步揭示了越南油茶茶籽油脂肪酸轉化的分子機制和不同組成的成因，為越南油茶品質育種和優質栽培提供了新思路。

4 結論

研究結果表明，越南油茶茶籽油的營養品質具有鮮明的地方特色，茶籽油存在棕櫚酸向硬脂酸、硬脂酸向油酸、油酸向亞油酸和亞油酸向亞麻酸的直接轉化過程；油茶不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例在10月5日達到最大值，說明選擇合適的采果日期是提高茶籽油飽不和脂肪酸比例的有效手段之一；SAD基因表達增強促進硬脂酸向油酸轉化，硬脂酸含量對FAD2基因表達、亞油酸含量對FAD3基因表達、SAD基因表達對FAD2基因表達和SAD基因表達對FAD3基因表達等均表現正調控作用。本文研究結果初步揭示了越南油茶茶籽油脂肪酸轉化的分子機制，在越南油茶品質育種和優質栽培技術的制定上具有一定的參考價值。