合成4-羥基異亮氨酸的大腸桿菌構建及其催化體系優化

李英滋，張 宇，王道安，董解榮，王子申，張成林, ，陳 寧

(1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 菱花集團有限公司，濟寧 272073)

4-羥基異亮氨酸為 L-異亮氨酸羥化物，具有血糖水平依賴的促進胰島素分泌的特性以及促進脂肪代謝等功能，對糖尿病具有良好的治療效果，具有廣闊的應用前景[1-6]．目前 4-羥基異亮氨酸的工業化生產主要采用胡蘆巴種子提取法，然而此方法生產效率低(約 0.015%)，致使生產規模小、產量低、成本高，嚴重限制了其應用[7-10]．此外，化學合成法因在生產過程中使用產生乙醛等有毒或易爆物，且存在提取收率低等不足，仍停留在實驗室研究階段[9-12]．Kodera等[9]在蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)中發現了由 ido編碼的異亮氨酸羥化酶(isoleucine dioxygenase，IDO)，該酶能夠以 L-異亮氨酸、α-酮戊二酸及氧氣為底物催化生成 4-羥基異亮氨酸、琥珀酸和二氧化碳(圖1[9])，為其生物合成提供重要基礎．

圖1 異亮氨酸羥化酶催化生成 4-羥異亮氨酸的反應示意圖Fig. 1 IDO catalyzing 4-hydroxyisoleucine synthesis

Kivero等[12]將異亮氨酸羥化酶編碼基因 ido轉化至大腸桿菌，并在發酵過程中添加 L-異亮氨酸，實現前體物添加法合成 4-羥基異亮氨酸，優化條件下產量為 163.0mmol/L；但該方法存在 L-異亮氨酸被額外消耗及耗糖高等不足．Shi等[13-15]利用谷氨酸棒桿菌過表達ido，在優化條件下經144h發酵，最高產量達到95.7mmol/L；但該方法發酵周期長，產酸水平較低．本課題組在前期研究[16-17]中從蘇云金芽胞桿菌B. thuringiensis TCCC 11826中克隆出ido(Accession No. KC884243)，利用該基因建立了微生物轉化法 4-羥基異亮氨酸合成體系，然而該方法產量較低(36h生成 44.6mmol/L)．此外，在轉化過程中底物L-異亮氨酸和α-酮戊二酸額外消耗嚴重，致使其轉化率偏低(89.3%)．本文針對上述問題，建立了靜息細胞法合成 4-羥基異亮氨酸體系，并對催化條件進行優化，實現其高效合成．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本文所用大腸桿菌Escherich coli BL21(DE3)以及質粒pXMJ-IDO和pET-28a均由本實驗室保藏．

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L)：胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0～7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min[18].

1.1.3 主要試劑

限制性內切酶、連接酶、DNA聚合酶等分子生物學試劑，寶生物工程(大連)有限公司；PCR產物回收、質粒提取等試劑盒，北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；4-羥基異亮氨酸、L-異亮氨酸及α-酮戊二酸標準品，美國Sigma 公司．

1.2 方法

1.2.1 ido過表達菌株E. coli pET-ido的構建

以含ido基因的重組質粒pXMJ-IDO為模板，利用引物 ido-A：CCGCATATGATGAAAATGAGTGG CTTTAGCATAG(NdeⅠ)和 ido-B：CCGCTCGAGT TATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA(XhoⅠ)，擴增 ido基因，經 NdeⅠ和 XhoⅠ酶切、回收后連接至經相同酶切的表達載體 pET-28a，然后轉化至大腸桿菌 E. coli BL21(DE3)感受態細胞．轉化子經菌落 PCR初步鑒定、活化后，提取重組質粒，分別利用 NdeⅠ以及 NdeⅠ和 XhoⅠ進行單、雙酶切驗證，并由蘇州金唯智生物科技有限公司測定質粒中 ido序列．分別將重組質粒和重組菌株命名為pET-ido和E. coli pET-ido．

1.2.2 重組IDO誘導表達及靜息細胞的培養和收集

將E. coli pET-ido于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中活化后，接種至 1L相同培養基，37℃、200r/min振蕩培養至A600為0.6～0.8時，加入IPTG(終濃度為 0.1mmol/L)，繼續培養 4h，4℃、5000g離心 30min，收集菌體．取少量菌體超聲破碎后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測[18]．菌體經生理鹽水清洗3次后，－80℃放置12h，即為靜息細胞．待催化反應結束后，將反應液 5000g離心30min，回收菌體并用生理鹽水清洗，稱量后重復利用．

1.2.3 靜息細胞法合成 4-羥基異亮氨酸的建立及條件優化

取靜息細胞(終質量濃度為20g/L)置于3L反應體系中，37℃反應 16h．反應體系為：100mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)，200mmol/L L-異亮氨酸和α-酮戊二酸，5mmol/L FeSO4，10mmol/L 維生素 C(VC)．進行反應條件優化時，根據需要改變相應條件．在單因素實驗的基礎上，進行正交實驗L9(34)對催化條件進一步優化．

1.2.4 L-異亮氨酸、4-羥基異亮氨酸和α-酮戊二酸的檢測

取反應液1mL，5000g離心1min后取上清液，經適當稀釋后采用 2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法測定 L-異亮氨酸和 4-羥基異亮氨酸濃度．檢測條件：安捷倫 C18色譜柱(150mm×4.6mm，3.5μm)，采用體積分數 50%乙腈/50mmol/L乙酸鈉為流動相梯度洗脫，流量 1mL/min，檢測波長360nm，柱溫 33℃[16]．α-酮戊二酸檢測條件：伯樂Aminex HPX-87H色譜柱(300mm×7.8mm，9μm)，流動相 5mmol/L H2SO4，流量 0.5mL/min，檢測波長 215nm，柱溫 30℃[19]．按式(1)—式(3)計算 3種物質的濃度(mmol/L)．

式中：S為利用高效液相色譜儀測定的 L-異亮氨酸、4-羥基異亮氨酸和α-酮戊二酸的峰面積．

1.2.5 4-羥基異亮氨酸產量和轉化率

4-羥基異亮氨酸產量以反應體系中其濃度計，按式(4)計算轉化率．

1.3 數據分析

每組實驗均設置3個平行并重復3次，分別利用軟件SPSS 13.0和Origin 8.0分析和處理實驗數據．

2 結果與分析

2.1 E. coli pET-ido的構建

ido基因 PCR產物經酶切后連接至表達載體pET-28a，經轉化、篩選獲得轉化子．挑取轉化單菌落進行菌落PCR鑒定，結果如圖2所示．

圖2 E. coli pET-ido菌落 PCR和重組質粒 pET-ido酶切驗證Fig. 2 PCR colony of E.coli pET-ido and pET-ido digested by restricted endonuclease

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，出現堿基數約為750bp的條帶，與理論值(738bp，含限制性內切酶酶切序列和保護堿基)接近．提取重組質粒，進行酶切驗證，質粒經單酶切獲得堿基數約為6000bp的條帶，與 pET-28a(5369bp)和 ido(732bp)的堿基數之和接近；質粒經雙酶切獲得堿基數分別為5000bp和750bp的條帶，分別與 pET-28a和 ido堿基數接近，表明ido過表達重組質粒pET-ido和菌株E. coli pET-ido構建成功．對該質粒中ido基因測序發現，其堿基序列未發生突變．

2.2 重組IDO的表達

收集經IPTG誘導的E. coli pET-ido菌體細胞，破碎物經SDS-PAGE檢測，結果如圖3所示．E. coli pET-ido菌體破碎液、破碎物上清液和沉淀中均出現相對分子質量約為 2.90×104的條帶，與其理論相對分子質量(2.892×104，包含 6個組氨酸標簽)接近，而對照菌株則未出現相應條帶．這表明重組 IDO能夠于E. coli pET-ido成功可溶性表達．

圖3 重組IDO的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE of recombinant IDO

2.3 靜息細胞法合成4-羥基異亮氨酸體系的構建

在工業化生產中，利用純酶進行催化合成 4-羥基異亮氨酸成本較高，采用微生物轉化法或全細胞催化法是較為理想的方法[20-21]．前期構建了大腸桿菌E. coli W3110轉化法合成 4-羥基異亮氨酸，但其合成量低(36h產量為 44.6mmol/L)[16]．其原因可能是細胞膜及細胞壁阻礙了 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸輸入以及4-羥基異亮氨酸輸出．同時，還發現在轉化過程中有部分 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸額外消耗．靜息細胞具有在反應過程中不生長、底物額外消耗量小以及底物和產物透過性強的特性[21]．以 E. coli pET-ido靜息細胞為酶源進行催化反應，結果如圖 4(a)所示．隨催化時間的延長，靜息細胞催化4-羥基異亮氨酸生成量增加，12h達到最高值 185.6mmol/L，此時轉化率為92.8%．而未經冷凍處理的活細胞僅能合成微量 4-羥基異亮氨酸(最高為 3.8mmol/L)．由異亮氨酸羥化酶催化反應特性可知(圖1)，生成該濃度4-羥基異亮氨酸需要消耗同等量的 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸．經檢測，靜息細胞對其實際消耗量分別為189.8mmol/L 和 189.5mmol/L(表 1)，由此可見二者幾乎無額外消耗．

圖4 靜息細胞合成 4-羥基異亮氨酸過程曲線及靜息細胞使用次數對4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 4 Production of 4-hydroxyisoleucine with resting cells and effect of recycle of resting cells on 4-hydroxyisoleucine production

靜息細胞重復使用次數對 4-羥基異亮氨酸合成的影響如圖 4(b)所示．靜息細胞連續使用 5次后其催化 4-羥基異亮氨酸合成量未見顯著降低，第 6次時略有降低，隨后迅速降低．由此可見，利用靜息細胞法可將L-異亮氨酸和α-酮戊二酸高效地轉化為4-羥基異亮氨酸，且靜息細胞可作為酶源被重復使用．

2.4 單因素優化靜息細胞法合成4-羥基異亮氨酸條件

2.4.1 底物濃度對4-羥基異亮氨酸合成的影響

考察了不同濃度 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸對4-羥基異亮氨酸合成的影響，結果如圖 5所示，隨二者濃度的增加，4-羥基異亮氨酸的合成量和轉化率均逐漸提高，250mmol/L時，其合成量最高(分別為196.7mmol/L和 198.3mmol/L)，但轉化率(分別為78.7%和 79.3%)較底物濃度為 200mmol/L時低．為探究靜息細胞法合成4-羥基異亮氨酸的潛在水平，選擇L-異亮氨酸和α-酮戊二酸添加量為250mmol/L．

圖5 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸添加量對 4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 5 Effect of L-isoleucine and α-ketoglutarate concentration on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.2 靜息細胞添加量對4-羥基異亮氨酸合成的影響

酶含量直接影響4-羥基異亮氨酸的合成效率，不同靜息細胞添加量對其合成的影響如圖6所示．

圖6 靜息細胞添加量對4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 6 Effect of resting cells concentration on 4-hydroxyisoleucine production

由圖 6可見：隨著靜息細胞添加量的增加，4-羥基異亮氨酸合成量提高，當添加量為 25g/L時產量和轉化率最高，分別為208.5mmol/L和83.4%．

2.4.3 溫度對4-羥基異亮氨酸合成的影響

溫度可通過影響異亮氨酸羥化酶活性影響 4-羥基異亮氨酸合成效率．如圖 7所示，4-羥基異亮氨酸生成量隨著溫度的升高而逐漸增加，35℃達到最高(208.6mmol/L)，隨后降低．前期研究結果表明，重組IDO 的最適反應溫度為 35℃[16]，這可能是該溫度條件下4-羥基異亮氨酸生成量達到最高的原因．

圖7 溫度對4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 7 Effect of temperature on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.4 pH對4-羥基異亮氨酸合成的影響

pH亦可通過改變異亮氨酸羥化酶活性影響 4-羥基異亮氨酸合成效率．如圖 8所示，隨 pH升高，4-羥基異亮氨酸合成量增加，pH 9.0時最高(216.9mmol/L)．然而，重組 IDO的最適反應 pH為7.0[16]．檢測發現，反應結束后該反應液的 pH 為6.8～7.5，故推測，其催化反應中由于 CO2的生成，致使反應體系pH降低．

圖8 pH對4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 8 Effect of pH on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.5 金屬離子對4-羥基異亮氨酸合成的影響

異亮氨酸羥化酶屬于 Fe2+和α-酮戊二酸依賴型羥化酶家族[10,22]，因此Fe2+對其活性影響較大．考察了 Fe2+濃度對 4-羥基異亮氨酸合成的影響(圖9)．由圖 9可知：不添加 Fe2+時，無 4-羥基異亮氨酸生成；隨 Fe2+濃度提高，4-羥基異亮氨酸合成量先增加后減少，Fe2+濃度為10mmol/L時其濃度最高．

圖9 Fe2+濃度對4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 9 Effect of Fe2+ on 4-hydroxyisoleucine production

Ca2+對 4-羥基異亮氨酸合成具有明顯抑制作用．然而，在一定濃度下 Na+、K+和 Mg2+對催化反應均具有促進作用，最高分別提高 3.76%、4.12%和5.69%．由于其促進作用并不明顯，故在后續實驗中不添加上述金屬離子．

2.4.6 VC對4-羥基異亮氨酸合成的影響

Fe2+容易被氧化為 Fe3+，從而影響異亮氨酸羥化酶活性，VC作為抗氧化劑可有效防止Fe2+氧化[23-24].考察了 VC濃度對 4-羥基異亮氨酸合成的影響(圖10)．由圖 10可知：不添加 VC時，4-羥基異亮氨酸生成量極低，其原因可能是Fe2+被氧化使得酶促反應難以進行；VC濃度為6mmol/L時，4-羥基異亮氨酸濃度最高．

圖10 VC濃度對4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 10 Effect of VC on 4-hydroxyisoleucine production

2.5 正交實驗優化靜息細胞法合成4-羥基異亮氨酸條件

由單因素實驗可知，pH、靜息細胞添加量以及Fe2+和VC濃度對4-羥基異亮氨酸的合成影響較大，因此利用正交實驗對上述條件進行進一步優化，結果見表 2和表 3．上述 4因素均能顯著影響 4-羥基異亮氨酸的合成(P＜0.05)，當 pH＝9.0、靜息細胞添加量為 27g/L、Fe2+和 VC 濃度分別為 8mmol/L和6mmol/L時，4-羥基異亮氨酸合成量達到最高值242.5mmol/L．

表2 正交實驗結果Tab. 2 Rerulto of orthogonal experiment

表3 實驗結果方差分析Tab. 3 Variance analysis of the results

2.6 最適條件下4-羥基異亮氨酸的合成及結果比較

利用上述最適條件(靜息細胞添加量 27g/L，L-異亮氨酸 250mmol/L，α-酮戊二酸濃度250mmol/L，FeSO48mmol/L，VC 6mmol/L，反應溫度 35℃，pH 9.0)進行驗證實驗．催化過程曲線如圖11所示，隨催化時間的增長，4-羥基異亮氨酸的產量以及 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸的消耗量逐漸提高，12h時4-羥基異亮氨酸產量和轉化率分別達到最高值249.6mmol/L和 99.8%，較優化前提高 34.5%和7.5%．該結果是目前已報道的生物法合成 4-羥基異亮氨酸的最高值，其主要指標比較見表4．

圖11 優化條件下4-羥基異亮氨酸生成過程曲線Fig. 11 Curve of the production process of 4-hydroxyisoleucine under optimized condition

表4 已報道的生物法合成4-羥基異亮氨酸主要指標及與本研究對比Tab. 4 Comparision of this study with the reported data of biosynthesis of 4-hydroxyisoleucine

3 結 語

為提高 4-羥基異亮氨酸合成效率，建立了靜息細胞法 4-羥基異亮氨酸合成體系，并避免了底物的額外消耗．在此基礎上，對催化條件進行優化，獲得最佳反應條件：靜息細胞 27g/L，L-異亮氨酸250mmol/L，α-酮戊二酸 250mmol/L，FeSO48mmol/L，VC 6mmol/L，反應溫度 35℃，pH 9.0．在此條件下，催化反應 12h，4-羥基異亮氨酸生成量和轉化率均達到最高值，分別為 249.6mmol/L和99.8%，較優化前提高34.5%和7.5%．

在催化過程中，靜息細胞內異亮氨酸羥化酶的平均催化速率為 0.67μmol/(min·mg)，低于純酶的催化速率 1.89μmol/(min·mg). 其原因可能是：(1)異亮氨酸羥化酶在 35℃條件下 4h后活性逐漸下降，10h后僅有 50%的活性．故推測，隨催化時間延長，異亮氨酸羥化酶穩定性越低，剩余酶活性越少，其催化效率降低．(2)催化 4h后，4-羥基異亮氨酸濃度高于130mmol/L，可能對異亮氨酸羥化酶存在反饋抑制作用．后續研究可針對上述問題對異亮氨酸羥化酶進行改造，以期獲得穩定性更高且解除反饋抑制作用的突變體，從而縮短催化周期．