無患子果皮提取物化學成分及其對白色念珠菌的抑制作用

邱金丹， 李 璐， 魏敏平， 謝云飛， 于 航， 姚衛蓉

(江南大學 食品學院， 江蘇 無錫 214122)

無患子，一種生長于中國南部和西部的落葉喬木，其果皮中含有的皂苷類成分已被廣泛應用于清潔產品[1]。目前，關于無患子果皮的化學成分及其生物活性已有一些報道，其化學成分主要為五環三萜類齊墩果烷型皂苷[2-3]。無患子果皮具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤活性等多種功效[3-4]。白色念珠菌是一種條件致病菌，可導致外陰陰道念珠菌病，影響女性生活質量[5]。目前，陰道局部用藥或口服唑類抗生素是首選治療方法，然而，過度使用抗生素會使白色念珠菌產生耐藥性[6]。因此，用抗真菌的天然產物治療念珠菌已成為研究重點。近年來，已有研究證明天然活性成分，如甲?；g苯三酚萜類化合物、原花色素聚合單寧等對白色念珠菌具有抑制作用，可導致其生物膜受損[7-8]。目前對無患子抑制白色念珠菌的研究主要集中在體外抑菌方面，如無患子甲醇提取物和醇提-大孔樹脂洗脫物對白色念珠菌的最低抑菌濃度分別為0.625和0.312 5 g/L[9-10]，90%無患子乙醇提取物可破壞白色念珠菌的細胞壁和細胞膜[5]。然而對無患子體內抑制白色念珠菌活性的研究較少，如用90%無患子乙醇提取物體內治療小鼠念珠菌，僅以真菌載量表示治療結果[11]，缺少對無患子體內抑制白色念珠菌活性的全面考察。本實驗室已經做了大量有關無患子的研究工作，包括無患子果皮總皂苷的分離提取及純化[1]，體外抑制真菌和細菌活性篩選[2-3]以及抗乳腺腫瘤研究[4]，積累了大量詳實數據。因此，基于前期研究結果，本研究采用水提發酵法和醇提法分別提取無患子果皮皂苷，得到水提發酵物(WFE)和醇提物(EE)，對其化學組成差異進行分析；并通過最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)指標考察提取物的體外抑制白色念珠菌活性；同時建立外陰陰道炎念珠菌(VVC)模型，考察2種提取物的體內治療效果，以期為無患子活性成分的分離鑒定及在醫藥領域的應用提供理論依據。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

無患子果皮，由福建源華林業生物科技有限公司提供，該樣品的標本存放于中國科學院昆明植物研究所植物標本室。無水乙醇、乙酸、高氯酸(70%～72%)、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、香草醛均為分析純，沙氏培養基，購自國藥集團化學試劑有限公司；齊墩果酸標準品(純度98%)和氟康唑(純度98.5%)，購自上海百靈威試劑公司；白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231，購自北京百歐博偉生物有限公司；安琪葡萄酒干酵母BV818，來自江南大學食品學院食品安全與質量控制研究中心。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；GI54DWS型立式壓力蒸汽滅菌器，廈門致微儀器有限公司；HWS恒溫恒濕培養箱，寧波江南儀器廠；沃特世MALDI SYNAPT MS型超高效液相色譜-質譜聯用儀，沃特世科技(上海)有限公司；恒溫水浴鍋，上海試驗儀器廠。

1.2 無患子果皮中皂苷的提取

1.2.1水提發酵法 參考文獻[12]，將一定質量無患子果皮粉碎至0.42～0.84 mm，在40 ℃的恒溫水浴鍋中，將果皮粉末與蒸餾水按照質量比1 ∶7提取8 h，用紗布過濾，濾渣再按質量比1 ∶3提取2 h，用紗布過濾，得到第二次濾渣再按質量比1 ∶1.5提取1 h，用紗布過濾得到第三次濾液，棄去濾渣，合并3次濾液。將粗濾液以5 000 r/min離心10 min得到無患子水提液，于蒸發設備中濃縮至體積為原水提液體積的1/6，得到無患子皂苷濃縮液。選擇安琪葡萄酒干酵母BV818為發酵菌株，以1.5%接種量，在30 ℃下發酵4 d得到無患子水提發酵物(WFE)。

1.2.2醇提法 將一定質量無患子果皮粉碎至0.42～0.84 mm，在75 ℃的恒溫水浴鍋中，將果皮粉末與70%的乙醇溶液按質量比1 ∶5混合提取3 h，用紗布過濾，將得到的濾渣在相同溫度、溶劑和質量比下再重復提取2次，合并3次濾液。將粗濾液以5 000 r/min離心10 min后，于蒸發設備中濃縮至體積為原醇提液體積的1/6，得到無患子醇提物(EE)。

1.3 無患子果皮提取物中總皂苷的測定

通過香草醛-濃硫酸分光光度法[1]測定無患子提取物中總皂苷含量。標準曲線的制作：配置1 g/L齊墩果酸標準溶液。取干燥潔凈的試管，分別加入0、30、60、90、120和150 μL齊墩果酸標準溶液，置于50 ℃水浴烘干水分，先后加入0.4 mL質量分數5%香草醛-冰醋酸溶液和1.4 mL高氯酸為顯色劑，振蕩混勻。置于70 ℃水浴中加熱20 min，冰水浴冷卻至室溫，再加入10 mL冰醋酸作為溶劑，充分混勻。用紫外分光光度計在540 nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，皂苷質量濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：A=0.003 5c-0.028 3,R2=0.998 9。樣品測定：將WFE和EE稀釋適當倍數，取100 μL稀釋液于試管中，重復上述操作測定。

固形物含量參照文獻方法測定[13]，無患子總皂苷得率(y)和純度(η)計算方法見式(1)～式(3)：

m1=c×n×V

(1)

y=m1/m0×100%

(2)

η=m1/m2×100%

(3)

式中：m1—無患子總皂苷質量，g；c—總皂苷質量濃度，g/L；n—稀釋倍數；V—提取液總體積，L；m0—無患子果皮質量，g；m2—固形物總質量，g。

1.4 無患子果皮提取物的化學成分分析

HPLC-DAD/MS檢測條件：BEC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動相A：乙腈，流動相B：水。在初始階段，梯度為40%A和60%B，20 min時為60%A和40%B，持續30 min。流速為1 mL/min，柱溫為45 ℃，進樣量5 μL。在負離子模式下使用電噴霧電離(ESI)源，N2霧化的壓力為275.8 kPa，在350 ℃ 的溫度下干燥N2的流速為9 L/min，毛細管電壓為3.0 kV，質量范圍(m/z)為100～3 000，離子源溫度為120 ℃。

1.5 無患子果皮提取物的抑菌活性研究

1.5.1最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照文獻[2]方法，分別配制無患子總皂苷終質量濃度為125、 62.5、 31.25和15.63 mg/L的固體培養基，在凝固后的試管培養基中加入20 μL活化后的106CFU/mL白色念珠菌ATCC10231菌懸液。以氟康唑作為陽性對照，以生理鹽水作為陰性對照，樣品及對照分別做3個平行。將加入菌株的培養基置放在恒溫恒濕培養箱內，37 ℃培養16～24 h后觀察結果，其中無菌落生長對應的濃度作為最小抑菌濃度(MIC)。

1.5.2最低殺菌濃度(MBC)的測定 參照文獻[13]方法，將無患子WFE和EE中總皂苷質量濃度稀釋接近MIC，分別在900 μL總皂苷質量濃度為555、 277、 139和69 mg/L的WFE和EE中加入106CFU/mL的菌懸液100 μL，得到總皂苷質量濃度為500、 250、 125和62.5 mg/L的混合液，37 ℃水浴保持60 min；吸取各含菌提取物100 μL涂布于沙氏培養基中，37 ℃培養16～24 h后觀察生長情況，其中無菌落生長對應的濃度作為最低殺菌濃度(MBC)。

1.5.3對白色念珠菌型陰道炎小鼠的治療作用 取40只八周齡小鼠(品系ICR)，隨機挑出8只作為空白對照組，其余隔天皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/只)刺激假發情，連續注射一周。最后一次刺激后，小鼠感染由PBS緩沖液配置的白色念珠菌菌懸液(108CFU/mL)，每只20 μL，連續感染兩天。隨機將小鼠分為4組，即陰性對照組、陽性對照組(氟康唑組)、WFE和EE組。通過陰道灌注的方式，空白對照組和陰性對照組灌注50 μL PBS緩沖液，陽性對照組灌注2 g/L氟康唑溶液，WFE和EE組分別灌注10 g/L的相應藥物，每天一次，持續11天，并在第0、5、10、11天用50 μL PBS緩沖液灌洗陰道3次，涂布于沙氏瓊脂平板確定真菌載量。取治療第11 d陰道灌洗液，酶聯免疫吸附(ELISA)測定細胞因子(IL-1β，IL-6，IL-8)和乳酸脫氫酶(LDH)。斷頸法處死小鼠，取陰道組織，石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察病理變化。

2 結果與討論

2.1 無患子果皮中皂苷的提取結果分析

采用水提發酵法和醇提法分別提取無患子果皮中的皂苷，得到WFE和EE中總皂苷得率分別為(13.05±0.82)%和(13.82±0.58)%，純度分別為(80.23±0.95)%和(75.50±0.31)%。2種方法均表現出良好的重現性，且得率相近，WFE純度更高，為80.23%。近年來，也有研究者用不同的方法提取無患子皂苷，如無水乙醇提取無患子果皮得到的皂苷得率為9.32%[14]；用9種不同的溶劑分別提取無患子皂苷，效果最好的提取溶劑是丙酮，純度為72.63%[15]。本研究中EE在得率和純度上都具有優勢，另外，在得率相近的前提下，WFE具有較高的純度，這是由于微生物具有豐富的分解糖類、蛋白質、脂類的酶類，但無法利用發酵液中皂苷類活性成分，從而達到去除雜質、保留富集有效成分的效果[15-16]。

2.2 無患子果皮提取物的化學成分分析

在負離子模式下對2種提取物進行HPLC-DAD/MS檢測，總離子流色譜圖如圖1所示，共鑒定出13種無患子皂苷，如表1所示。由圖1和表1可知，皂苷類物質的出峰時間主要在10～20 min之間，其中WFE和EE的三萜皂苷各占66.07%和80.39%。2種提取物中有11種共有皂苷，其中6種倍半萜皂苷和5種三萜皂苷。WFE中峰面積最大的皂苷為Sapindoside B，占總峰面積的42.35%。EE中峰面積最大的皂苷為Sapinmusaponin L，占總峰面積的46.75%，這兩種皂苷均屬于三萜皂苷。據報道[17]，無患子三萜皂苷具有較強的抗真菌功效，從無患子水提物中分離出的齊墩果烷型三萜皂苷對紅色毛癬菌具有抑制作用。另外，無患子果皮中皂苷的抗真菌活性及其構效關系的結果表明倍半萜皂苷混合物無抑菌活性[22]。因此，三萜皂苷是無患子果皮中具有極大利用價值的一類皂苷，可以用來進一步的深入利用，也可作為抑菌活性物質分離的目標。

表1 無患子WFE和EE化學成分分析
Table 1 Component analysis of WFE and EE

類型type編號No.化合物名稱 compound name 分子式formula峰面積peak area/%WFEEE參考文獻reference倍半萜皂苷sesquiterpene saponins1mukuroziosideⅠbC45H76O240.630.43[2]2mukuroziosideⅡbC51H86O283.763.81[2]3mukuroziosideⅠaC45H78O245.904.29[2]4mukuroziosideⅡaC51H88O288.665.86[2]5pyishiauosideⅠbC33H56O154.531.08[2]66′/4″/6″″/4″″-O-acetylmukurozioside ⅡaC53H90O2910.454.14[16]三萜皂苷triterpenoid saponins7mukurozisaponin YC58H94O264.432.36[2]8sapindoside CC46H74O163.353.41[17]9matesaponin 1/1′C47H76O171.87—[18]10sapindoside BC46H74O1642.3525.00[19～20]11sapinmusaponin LC48H76O1712.8246.75[21～22]12oleanolicacid 3-O-α-L-arabinofuranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosideC46H74O151.251.77[17]13mukurozisaponin GC50H78O18—1.1[23]

2.3 無患子果皮提取物的抑菌活性分析

采用最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)來比較無患子WFE和EE(以總皂苷計)對白色念珠菌的體外抑菌活性，結果發現：WFE、EE和氟康唑的MIC值分別為62.50、 31.25和2.00 mg/L，MBC值分別為250、 125和4.00 mg/L。當MIC值低于100 mg/L時，植物提取物的體外活性被認為是顯著的[23]。因此，無患子WFE和EE均具有顯著的體外抑制白色念珠菌的作用，可以將無患子果皮提取物作為醫藥原料進行深入開發。

2.4 無患子果皮提取物的體內抑菌活性

2.4.1真菌載量 小鼠陰道灌洗液的真菌載量能直觀地反映白色念珠菌的變化，結果見表2。治療前(0 d)，與空白組比較，陰性對照組、陽性對照組、WFE組和EE組陰道內菌落均顯著增加(P<0.05)；與陰性對照組相比，陽性組、WFE組和EE組均無顯著性差異，表明已成功建立小鼠陰道炎模型。

各組別菌落數結果表明：從治療開始，菌落數隨著時間推移逐漸減少；治療第10 d，與陰性對照組相比，WFE組與陽性對照組陰道內真菌載量均顯著下降(P<0.05)，說明氟康唑和WFE能夠抑制小鼠體內白色念珠菌活性，而EE組在治療的11 d中，小鼠陰道內真菌載量均無顯著下降，說明EE不能有效抑制白色念珠菌的生長。

表2 無患子WFE和EE對VVC小鼠陰道內真菌載量的影響1)

1) #：與空白組比較compared with blank group，P<0.05；與陰性對照組比較compared with negative control group，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；下表同the same as following table

2.4.2炎癥因子 白色念珠菌從酵母到菌絲的形態轉變可導致陰道上皮細胞的損傷，誘發炎癥反應，產生炎癥因子[24]。炎癥因子指標高，表示陰道上皮細胞炎癥反應嚴重，炎癥因子指標降低，表示白色念珠菌對上皮細胞的損傷得到減輕，活性受到抑制。

測定了3個與陰道炎相關的炎癥因子指標(IL-1β，IL-6和IL-8)，結果見表3。與空白組相比，陰性對照組的IL-1β，IL-6和IL-8顯著升高(P<0.05)，表明白色念珠菌已感染陰道上皮細胞，誘發炎癥反應，說明小鼠陰道炎造模成功。與陰性對照組相比，陽性對照組和WFE組的IL-6和IL-8顯著降低(P<0.05)，EE組無顯著性差異，表明陽性藥物氟康唑和WFE能夠減輕陰道上皮細胞炎癥反應，抑制白色念珠菌的活性，具有治療作用，而EE組不能抑制白色念珠菌活性，無治療作用。陽性對照組與WFE組的IL-6和IL-8無顯著性差異，說明10 g/L WFE的抑制作用與2 g/L氟康唑相當。

2.4.3乳酸脫氫酶 乳酸脫氫酶(LDH)可以判別由白色念珠菌引起的陰道組織損傷程度。如表3所示，與空白組相比，陰性對照組的LDH指標顯著升高(P<0.05)，表明小鼠陰道炎造模成功。與陰性對照組相比，陽性對照組、WFE組和EE組的LDH指標顯著降低(P<0.05)，表明3個治療組均能夠減輕白色念珠菌引起的組織損傷程度，具有治療作用。WFE組與陽性對照組的LDH指標無顯著性差異，卻比EE組顯著降低(P<0.05)，說明10 g/L WFE的治療效果與2 g/L氟康唑相當，且優于EE。

表3 無患子WFE和EE對VVC小鼠陰道內炎癥因子和乳酸脫氫酶的影響

2.4.4病理切片 小鼠陰道組織由管腔(L)，黏膜(M)和黏膜下層(SM)組成[25]。如圖2所示，空白組小鼠組織排列清晰，層次分明；陰性對照組的黏膜層(M)增厚，部分上皮細胞嚴重壞死脫落(箭頭標注處)。與陰性對照組相比，陽性對照組、WFE組和EE組的黏膜層(M)均較薄，上皮細胞僅有輕微脫落現象，表明3者都能不同程度地減輕白色念珠菌感染陰道組織的癥狀；且WFE組的改善效果比EE組的稍好；但與未感染前的空白對照組相比，治療11 d后， 3者的黏膜層(M)都不能恢復到未感染前的狀態。

L.管腔lumen; M.黏膜mucosa; SM.黏膜下層submucosa a.空白blank； b.陰性對照negative control； c.陽性對照positive control； d.WFE； e.EE圖2 無患子WFE和EE對VVC小鼠陰道組織病理改變的影響(×200)Fig.2 Effect of WFE and EE on vaginal histopathological examinations(×200)

據報道，對64種天然產物進行體內外抑菌實驗，結果僅有16種體內外抑菌一致性[26]。因此，本研究在考察無患子WFE和EE體外抑菌活性的基礎上，比較了兩者的體內抑菌效果。研究證明：與陰性對照組相比，WFE能夠有效抑制小鼠陰道內白色念珠菌的生長，降低炎癥因子(IL-6，IL-8)的合成和釋放，WFE和EE均能減輕陰道組織損傷程度，但EE的治療效果較差。該研究結果證明無患子果皮提取物體內外抑制白色念珠菌活性一致性，可以為開發無患子果皮應用于醫藥領域提供理論依據。

3 結 論

3.1采用水提發酵法和醇提法提取無患子果皮，得到WFE和EE這2種提取物，通過HPLC-DAD/MS對提取物的化學成分進行分析。結果表明：WFE中總皂苷純度(80.23%)高于EE純度(75.50%)，提取物中共有13種無患子皂苷，包括7種三萜皂苷和6種倍半萜皂苷，其中三萜皂苷為主要成分，在WFE和EE中分別為66.07%和80.39%。

3.2采用最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)作為抑菌指標，比較了2種無患子提取物的體外抑菌作用，結果表明：WFE(MIC值為62.5 mg/L, MBC值為250 mg/L)和EE(MIC值為31.25 mg/L,MBC值為125 mg/L)均具有顯著的體外抑菌活性。

3.3建立外陰陰道炎念珠菌(VVC)小鼠模型，考察2種提取物的體內治療效果，結果顯示：與陰性對照組相比，WFE能顯著降低(P<0.05)VVC小鼠陰道內的真菌載量和炎癥因子(IL-6，IL-8)，減輕陰道組織損傷程度；而EE僅能減輕組織損傷程度，且效果較WFE差。因此，無患子果皮提取物具有體內外抑制白色念珠菌活性的作用，從治療角度，WFE效果更好。