抗腫瘤候選藥物Gedatolisib在體外血漿和人工胃/腸液中的穩定性研究及其降解產物分析

武婷婷 張宇 杜瑤 陳瑞 王麗麗 彭鴻曼 湯磊 王穎 張吉泉

中圖分類號 R969.1;R979.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）12-1452-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.09

摘 要 目的：考察抗腫瘤候選藥物Gedatolisib在體外血漿和人工胃/腸液中的穩定性，并分析其在體外血漿中可能的降解產物。方法：采用高效液相色譜法，以吲哚美辛為內標，分別檢測Gedatolisib在SD大鼠（雄性）血漿中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h和在空白人工胃液（pH 1.3，不含酶）、空白人工腸液（pH 6.8，不含酶）、人工胃液（pH 1.3，含胃蛋白酶）、人工腸液（pH 6.8，含胰蛋白酶）中孵育0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 h的含量變化，計算其剩余百分比;利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術分析空白血漿和血漿孵育樣品的總離子流圖，比較差異峰并通過MS圖推測降解產物。結果：Gedatolisib在大鼠血漿中孵育2.0 h時的剩余百分比約為63%，繼續孵育無明顯變化;在空白人工腸液中孵育不同時間的剩余百分比均在（99.18±2.15）%～（103.20±3.41）%范圍內;在人工腸液中孵育2.0 h的剩余百分比降至（88.76±1.53）%，在空白人工胃液中孵育2.0 h的剩余百分比降至（85.63±1.55）%，繼續孵育均無明顯變化;在人工胃液中孵育的剩余百分比從0 h的（94.94±3.52）%降至6.0 h的（16.19±1.17）%。UPLC-Q-TOF/MS的總離子流圖顯示，血漿孵育樣品與空白血漿的差異峰出現在正離子模式掃描下的6.42 min處，該峰掃描通道可見m/z 616.335 1、632.327 7、630.317 0、602.278 6[M+H]+的分子離子峰，推測Gedatolisib在大鼠血漿中可能生成1-（4-（3-（4，6-雙嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲基）苯甲?；?N，N-二甲基哌啶-4-氧化胺、1-（4-（4-（二甲基氨基）哌啶-1-羰基）苯基）-3-（4-（4-嗎啉-6-（3-氧代嗎啉）-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲和1-（4-（3-（4-（4，6-雙嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲基）苯甲?；?N-甲基哌啶等3個降解產物。結論：Gedatolisib在大鼠血漿中不穩定，可能發生末端氮原子氧化、嗎啉環氧化和末端氮脫甲基化等反應;在人工腸液和空白人工胃/腸液中穩定性良好，在胃蛋白酶存在下發生明顯降解。

關鍵詞 抗腫瘤候選藥物;Gedatolisib;體外血漿;人工胃液;人工腸液;穩定性;降解產物

Study on the Stability of Antitumor Candidate Gedatolisib in Plasma in vitro and Simulated Gastric/intestinal Fluid and Its Catabolites Analysis

WU Tingting1，ZHANG Yu1，DU Yao1，CHEN Rui2，WANG Lili3，PENG Hongman4，TANG Lei2，WANG Ying1，ZHANG Jiquan1，2（1. College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China; 2. Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China; 3. School of Medicine and Health Management， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China;4. Dept. of Clinical Teaching， Guiyang Maternal and Child Health Hospital， Guiyang 550003， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the stabilities of antitumor candidate Gedatolisib in plasma in vitro and simulated gastric/intestinal fluids，and to analyze the possible catabolites in plasma. METHODS： HPLC method was adopted. Using indometacin as internal standard，the contents of Gedatolisib incubated in plasma of SD rats （male） for 0， 0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 3.0 h and blank simulated gastric fluid （pH 1.3， no enzyme）， blank simulated intestinal fluid（pH 6.8，no enzyme）， simulated gastric fluid （pH 1.3， containing pepsin） and simulated intestinal fluid （pH 6.8， containing trypsin） for 0， 0.5， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 6.0 h were determined. The remaining percentage of Gedatolisib was calculated. UPLC-Q-TOF/MS was used to analyze the TIC of blank plasma and incubated samples. The differential peaks were compared， and catabolites were inferred by MS chromatograms. RESULTS： The remaining percentage in plasma of rats for 2.0 h was about 63%， and there was no significant change after continued incubation. The remaining percentage of Gedatolisib incubated in blank simulated intestinal fluid for different time ranged（99.18±2.15）%-（103.20±3.41）%. The remaining percentage in simulated intestinal fluids for 2.0 h ranged （88.76±1.53）%. The remaining percentage in blank simulated gastric fluids for 2.0 h was ranged （85.63±1.55）%， and there was no significant change after continued incubation. The remaining percentage in simulated gastric fluid was from （94.94±3.52）% （0 h）to （16.19±1.17）%（6.0 h）. TIC of UPLC-Q-TOF/MS showed that the differential peaks of incubated samples and blank plasma was 6.42 min under positive mode scanning， molecular ion peak of m/z 616.335 1， simulated 632.327 7， 630.317 0， 602.278 6 [M+H]+ could be found in scanning channel. It was speculated that Gedatolisib could generate 1-（4-（3-（4，6-dimorpholino-1，3，5-triazin-2-yl）phenyl）urea）benzoyl）-N， N-dimethylpiperidin-4-amine oxide， 1-（4-（4-（dimethylamino）piperidine-1-carbonyl）phenyl）-3-（4-（4-morpholino-6-（3-oxomorpholino）-1，3，5-triazin-2-yl）phenyl）urea and 1-（4-（3-（4-（4，6-dimorpholino-1，3，5-triazin-2-yl）phenyl）urea）benzoyl）-N-methylpiperidine. CONCLUSIONS： Gedatolisib is not stable in rat plasma， and it may undergo terminal N oxidation， morpholine ring oxidation and terminal N demethylation. Gedatolisib is stable in artificial intestinal fluid and blank artificial gastric/intestinal fluid， and degrades obviously in the presence of pepsin.

KEYWORDS ? Antitumor candidate; Gedatolisib; Plasma; Simulated gastric fluid; Simulated intestinal fluid; Stability; Catabolite

小分子靶向抗腫瘤候選藥物Gedatolisib由美國Pfizer公司開發，目前處于Ⅱ期臨床研究階段。該化合物能夠通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-Akt-mTOR）通路中的PI3Kα、PI3Kγ及mTOR，有效抑制人乳腺癌細胞MDA-361和人前列腺癌細胞PC3-MM2的增殖[1]。有臨床研究表明，靜脈注射Gedatolisib對乳腺癌、子宮內膜癌、胰腺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤細胞均有顯著的抑制作用[2]。

口服藥物進入生物體內發揮藥效，必須經歷吸收、分布、代謝、排泄的復雜過程。例如，化合物在血漿和消化道中易受血漿酶、胃腸pH、胃腸液酶的影響，使其降解失活甚至生成毒性產物，直接影響化合物的有效性和安全性[3-4]，故對Gedatolisib的血漿和胃腸液穩定性進行研究并探討其影響因素顯得尤為重要。自Gedatolisib開展臨床研究以來，均采用靜脈注射的方式給藥。Gedatolisib具有較高的脂溶性（clogP=1.2）和大于500的分子量（615.739 0）[1]，以上兩點均可能導致其水溶性差。該化合物雖不適合口服，但至今尚無相關文獻解釋其臨床研究中僅以靜脈注射給藥的原因，也未見對其穩定性及代謝物分析的研究報道。本課題組前期成功合成了Gedatolisib[5]，在此基礎上，本研究采用高效液相色譜法（HPLC），以吲哚美辛為內標，考察Gedatolisib在SD大鼠體外血漿和人工胃/腸液中的穩定性;同時，本研究利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜技術（UPLC-Q-TOF/MS），對空白血漿和血漿孵育樣品的圖譜進行比較，利用UNIFI 1.8.2數據庫對Gedatolisib可能的降解產物進行解析，挖掘其潛在代謝位點，從而初步闡明Gedatolisib可能的體內代謝行為，旨在填補Gedatolisib穩定性研究方面的空白，為其后續結構改造與優化提供理論參考。Gedatolisib和吲哚美辛的結構式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS 型UPLC-Q-TOF/MS 儀（包括MassLynx V4.1型質譜工作站、UNIFI 1.8.2數據庫）和e2695型HPLC儀（美國Waters公司）;XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫療用品有限公司）;JN300-2型氮氣吹掃儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）;KH-600E型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）;FA805N型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

Gedatolisib原料藥（貴州醫科大學藥物化學重點實驗室自制，批號：20190410，純度：>99.0%）;吲哚美辛對照品（內標，大連美侖生物技術有限公司，批號：J0526A5，純度：>98%）;肝素鈉（北京索萊寶科技有限公司，批號：325D025）;甲醇、乙腈為色譜純;磷酸等其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，雄性，8～12周，體質量220～230 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014。

2 方法與結果

2.1 Gedatolisib含量測定的色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.5 mm，5 μm）;保護柱：Waters Symmetry C18 VanGuard Cartidge（5 mm×3.9 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，45%A→95%A;7～10.5 min，95%A;10.5～12 min，95%A→45%A;12～12.5 min，45%A）;流速：1 mL/min;檢測波長：254 nm;柱溫：35 ℃;進樣量：20 μL。

2.2 降解產物定性分析的UPLC-Q-TOF/MS條件

色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：0.01%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，95%A;2～8 min，95%A→45%A;8～12 min，45%A→5%A;12～13 min，5%A;13～15 min，5%→95%A）;流速：0.40 mL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：2 μL;分析時間：15 min。離子源：電噴霧離子源（ESI）;采集模式：正離子;毛細管電壓：1.5 kV;離子源溫度：120 ℃;溶劑氣溫度：400 ℃;脫溶劑氣流量：800 L/h;錐孔氣流量：50 L/h;掃描方式：MSE Continuum模式;掃描范圍：m/z 50～1 200。

2.3 溶液的制備

2.3.1 Gedatolisib對照品貯備液及對照品溶液

精密稱取Gedatolisib原料藥適量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液，于4 ℃貯存。使用前用甲醇稀釋得到相應質量濃度的對照品溶液。

2.3.2 內標貯備液及內標溶液

精密稱取內標對照品適量，以甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，制成質量濃度為1 mg/mL的內標貯備液，于4 ℃貯存。使用前用甲醇稀釋得到相應質量濃度的內標溶液。

2.3.3 空白人工胃液的制備

按文獻方法[6]，取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調pH至1.3，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得空白人工胃液。

2.3.4 人工胃液的制備

按文獻方法[6]，取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻使其溶解，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調pH至1.3，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液。

2.3.5 空白人工腸液的制備

按文獻方法[6]，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL，搖勻使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至6.8，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得空白人工腸液。

2.3.6 人工腸液的制備

按文獻方法[6]，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL，搖勻使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至6.8;另稱取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解;將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工腸液。

2.4 樣品采集、配制與處理

2.4.1 空白血漿采集

取清潔級大鼠6只，于股動脈采血，分別置于含肝素鈉的離心管中，于4 ℃下以3 000×g離心10 min，取上層血漿于-80 ℃貯存，備用。

2.4.2 血漿樣品配制

按文獻方法[6]，取大鼠空白血漿198 μL，分別加入低、中、高質量濃度（2、10、30 μg/mL）的Gedatolisib對照品溶液（含醇量為1%）2 μL，振蕩混勻，在37 ℃水浴中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h。

2.4.3 人工胃/腸液樣品配制

精密量取質量濃度為1 mg/mL的Gedatolisib對照品溶液4份，每份50 μL，分別置于5 mL EP管中，分別用空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液稀釋至刻度（含醇量均為1%）;再用EP管分裝200 μL，振蕩混勻，于37 ℃水浴中孵育0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 h。

2.4.4 血漿樣品處理

取“2.4.2”項下樣品200 μL，加入質量濃度為5 μg/mL的內標溶液400 μL，渦旋5 min混勻，于4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液于37 ℃下以氮氣流吹干，殘渣加甲醇100 μL復溶，渦旋5 min混勻，于4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液備測。

2.4.5 人工胃/腸液樣品處理

取“2.4.3”項下樣品200 μL，加入質量濃度為5 μg/mL的內標溶液400 μL，渦旋5 min混勻，于4 ℃下以20 000×g離心10 min，取上清液備測。

2.5 生物樣品定量分析方法學考察

2.5.1 專屬性考察

分別取空白血漿、空白血漿+Gedatolisib對照品（100 μg/mL）、血漿樣品（10 μg/mL Gedatolisib孵育0.5 h），除空白血漿不加入內標外其余均按“2.4.4”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖;另取空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液、人工胃液+Gedatolisib對照品（100 μg/mL）、人工腸液+Gedatolisib對照品（100 μg/mL）、人工胃液樣品（10 μg/mL Gedatolisib孵育0.5 h）、人工腸液樣品（10 μg/mL Gedatolisib孵育0.5 h），除空白人工胃腸液和人工胃腸液不加入內標外其余均按“2.4.5”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，Gedatolisib和內標均能同時被檢出，保留時間分別為6.94、9.42 min，分離度良好，不受內源性物質干擾，詳見圖2。

2.5.2 線性關系考察

取大鼠空白血漿、空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液和人工腸液各198 μL，分別精密加入不同質量濃度的Gedatolisib對照品溶液2 μL，制成Gedatolisib質量濃度依次為0.5、1、2、5、10、20、40 μg/mL的樣品溶液（含醇量為1%），渦旋5 min混勻，分別按“2.4.4”“2.4.5”項下方法處理，記錄峰面積。以Gedatolisib峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（y）、Gedatolisib的質量濃度為橫坐標（x）進行回歸分析，得Gedatolisib在空白血漿中的回歸方程為y=0.034 5x-0.008 9（R2=0.999 6），在空白人工胃液中的回歸方程為y=0.035 1x-0.004 3（R2=0.999 1）、在空白人工腸液中的回歸方程為y=0.033 4x-0.005 2（R2=0.999 5）、在人工胃液中的回歸方程為y=0.034 4 x-0.008 6（R2=0.999 3）、在人工腸液中的回歸方程為y=0.033 8x-0.001 8（R2=0.999 4）。結果表明，Gedatolisib檢測質量濃度的線性范圍均為1～40 μg/mL，定量下限均為1 μg/mL。

2.5.3 準確度、精密度、穩定性試驗

取大鼠空白血漿、空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液和人工腸液各198 μL，分別精密加入不同質量濃度的Gedatolisib對照品溶液2 μL，制成定量下限質量濃度（1 μg/mL）樣品溶液和低、中、高質量濃度（2、10、30 μg/mL）質控樣品溶液（含醇量為1%），每質量濃度平行5份，分別按“2.4.4”“2.4.5”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算Gedatolisib含量，以測得值與真實值進行比較，考察準確度。以含量的RSD考察日內精密度;連續進樣3 d，同法考察日間精密度。將上述處理后的樣品溶液于室溫下放置12 h，再進樣分析，以含量的RSD考察穩定性。結果見表1（表中結果均以檢測值范圍表示）。

2.6 Gedatolisib在SD大鼠血漿中的穩定性考察

按“2.4.2”項下方法配制血漿樣品，按“2.4.4”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算各樣品中藥物的質量濃度。每樣品平行測定3次。以孵育前各樣品中藥物的理論質量濃度（分別為2、10、30 μg/mL）計算各孵育時間點的藥物剩余百分比。結果，Gedatolisib在大鼠血漿中孵育2.0 h時剩余百分比約為63%（n=3），繼續孵育Gedatolisib的剩余百分比無明顯變化，推測降解反應達到平衡，詳見表2。

2.7 Gedatolisib在人工胃/腸液中的穩定性考察

按“2.4.3”項下方法配制人工胃/腸液樣品，按“2.4.5”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按標準曲線法計算各樣品中藥物的質量濃度。每樣品平行測定3次。以孵育前各樣品中藥物的理論質量濃度（10 μg/mL）計算各孵育時間點的藥物剩余百分比。結果，Gedatolisib在空白人工腸液中孵育不同時間的剩余百分比均在（99.18±2.15）%～（103.20±3.41）%范圍內;在人工腸液中孵育至2.0 h時剩余百分比低至（88.76±1.53）%，之后隨著時間延長，剩余百分比無明顯變化;Gedatolisib在空白人工胃液中孵育2.0 h時剩余百分比低至約（85.63±1.55）%，之后隨著時間延長，剩余百分比無明顯變化;在人工胃液中的剩余百分比從0 h的（94.94±3.52）%下降至6.0 h的（16.19±1.17）%，詳見表3。

2.8 Gedatolisib的降解產物檢測試驗

由于孵育時間內人工胃液中藥物剩余百分比過低，剩余量無法保證有效濃度，難以保證藥效發揮;另外，在空白人工胃液、空白人工腸液、人工腸液中Gedatolisib表現穩定，此外因Gedatolisib以靜脈注射給藥，所以僅選取血漿樣品進行降解產物分析。采集在“2.6”項下穩定性試驗中Gedatolisib剩余百分比最低的孵育體系（即質量濃度為10 μg/mL孵育2.0 h的血漿樣品）為體外孵育樣品，并以未加入Gedatolisib的孵育溶液（空白血漿）為空白樣品，按“2.2”項下條件進樣分析，比較空白樣品和體外孵育樣品的總離子流圖（見圖3），找出差異峰;通過MSE Continuum模式獲得各色譜峰的準分子離子及碎片離子信息;利用UNIFI 1.8.2數據庫推測Gedatolisib的降解產物。

由圖3可見，體外孵育樣品與空白樣品的差異峰出現在正離子模式掃描下的6.42 min處。該差異峰的MS掃描通道可見m/z 616.335 1、632.327 7、630.317 0、602.278 6[M+H]+的分子離子峰。其中，準分子離子峰m/z ?616.335 1[M+H]+為原型化合物Gedatolisib（見圖4）;根據降解產物中的準分子離子峰m/z 632.327 7[M+H]+推測，Gedatolisib結構中的末端氮原子可能發生氧化，生成降解產物，即1-（4-（3-（4，6-雙嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲基）苯甲?；?N，N-二甲基哌啶-4-氧化胺（M1，MS圖見圖5A）;根據降解產物的準分子離子峰m/z 630.317 0[M+H]+推測，Gedatolisib結構中的嗎啉環可能發生氧化，生成降解產物，即1-（4-（4-（二甲基氨基）哌啶-1-羰基）苯基）-3-（4-（4-嗎啉-6-（3-氧代嗎啉）-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲（M2，MS圖見圖5B）;根據降解產物準分子離子峰m/z 602.278 6[M+H]+推測，Gedatolisib結構中的末端氮原子可能發生脫甲基化，生成降解產物，即1-（4-（3-（4-（4，6-雙嗎啉-1，3，5-三嗪-2-基）苯基）脲基）苯甲?；?N-甲基哌啶（M3，MS圖見圖5C）。

3 討論

定量分析方法驗證的目的與意義在于考察Gedatolisib、內標與所含基質組分是否能夠有效分離以及在所建立的檢測條件下是否能夠準確定量。因此，本研究前期考察了孵育體系中存在的緩沖鹽、血漿中各種酶對待測物定量分析的影響。結果顯示，Gedatolisib和內標均能有效分離，且內源性物質無干擾。

化合物通過在體外與血漿共同孵化，能夠快速確定該化合物在血漿中是否易發生降解及其降解的程度。參考文獻研究[4]和前期試驗，Gedatolisib在SD大鼠血漿中穩定性的孵育時間選定在3.0 h，在人工胃腸液中穩定性的孵育時間選定為6.0 h。

Gedatolisib分子末端是由富余電子的氮原子和兩個供電子的甲基構成，二甲氨基結構中氮弱堿性導致其極易被氧化，也常發生末端脫甲基化。與其他含氮雜環（如哌啶或嘧啶）相比，Gedatolisib結構中的嗎啉環由于氧原子的誘導作用和氮原子的弱堿性，形成了一個相對缺電子的雜環體系，使得嗎啉環易被氧化成內酯或內酰胺，該結構在酸性環境下易發生開環[7]。

本研究在Gedatolisib的穩定性實驗中發現，在血漿中孵育一段時間后Gedatolisib剩余百分比能夠達到平衡，而在人工胃液（pH 1.3）中，Gedatolisib則呈現出不可逆的降解。這可能是該化合物在多項臨床試驗中均采用靜脈給藥而非口服給藥的重要原因。

本研究建立了在血漿、人工胃/腸液等生物樣品中Gedatolisib的含量測定方法，考察了Gedatolisib在上述生物樣品中孵育3～6 h的穩定性;同時，利用UPLC-Q- TOF/MS技術結合UNIFI 1.8.2數據庫對體外血漿中Gedatolisib的降解產物進行分析，初步確定找到了Gedatolisib結構中易發生降解的部位，為后續同類衍生物的結構改造以及該化合物的劑型開發和聯合用藥方案提供重要參考。

參考文獻

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（收稿日期：2020-02-20 修回日期：2020-05-12）

（編輯：鄒麗娟）