利用CRISPR/Cas9技術對雞AMHR2基因進行精確編輯

黃思嘉，祝夢琦，李鵬程，張智英，魏澤輝

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

產蛋性狀是家禽生產的重要經濟性狀之一，產蛋性能的高低主要取決于雞卵泡發育過程中的卵泡選擇和優先等級建立[1]。雞的卵泡選擇主要通過下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic-pituitary-ovarianaxis, HPOA)與神經內分泌系統相互協調作用，并由生殖激素和一系列功能基因調控?？箍娎帐瞎芗に?anti-müllerian hormone, AMH)是轉化生長因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)超家族BMP/GDF/AMH亞家族的成員之一[2]，在雞的卵泡發育過程中起著重要作用。

禽類的AMH在雌性胚胎和雄性胚胎的性腺中均有表達，但在雄性胚胎中AMH的表達量更高，主要起到使雄禽雙側繆勒氏管和雌禽右側繆勒氏管退化的作用[3-4]。有研究表明，在雞的卵泡發育過程中，AMH的表達量隨著卵泡發育而降低，尤其是在卵泡選擇后AMH的表達量顯著下調，直至在F1的顆粒細胞中幾乎不表達[5]，這表明AMH與卵泡選擇密切相關。然而，目前還沒有研究能夠清楚地解釋AMH在調控雞卵泡選擇過程中的具體分子機制。

TGF-β家族成員主要通過兩個相關的Ser/Thr激酶Ⅰ型受體和Ⅱ型受體結合生成異二聚體復合物進行胞外至胞內的信號轉導。在配體與跨膜Ⅱ型受體結合后，Ⅰ型受體被募集與Ⅱ型受體形成受體復合物，激活下游Smad蛋白進而調控目的基因的表達[6]。作為TGF-β家族的成員之一，AMH信號轉導與其他成員相似，其Ⅱ型受體(anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor, AMHR2)是AMH目前唯一已知的Ser/Thr激酶Ⅱ型受體，在剛出生的雌性胎兒卵巢中即有表達并貫穿卵泡發育的整個過程[7-8]。近年來，已有學者對雞的AMHR2基因結構及功能展開了研究。Ayers[9]通過轉錄組測序從頭組裝并與其他物種的基因組序列進行校準得到了雞的AMHR2基因序列。Cutting[10]通過比對雞AMHR2基因與Pfam數據庫中其他物種AMHR2基因的對應區域，鑒定了雞AMHR2基因中配體結合、跨膜、激酶、磷酸化受體和DNA結合區域的序列。其中，配體結合域包含幾個高度保守的半胱氨酸殘基，符合TGF-β家族受體的特征。AMHR2在未進行性別分化和正在分化的雌性和雄性雞胚的性腺和繆勒氏管中均有表達，在鳥類性別分化過程中發揮重要作用[10]。Mishina[7]通過試驗發現，缺乏AMHR2表達的雄性小鼠繆勒氏管的退化程度相對于正常雄性小鼠減弱。另外，Imbeaud[11]發現AMHR2基因突變可能會導致持久性繆勒氏管綜合癥。以上試驗均驗證了AMHR2在AMH信號轉導中的重要性，因此敲除AMHR2基因能夠阻礙AMH的信號轉導，進而影響AMH在雞卵泡發育和卵泡選擇中的作用。

近年來，CRISPR/Cas9技術逐漸發展成熟，已在禽類基因組的特異性敲除試驗中成功應用[12-13]。本研究通過構建靶向雞AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除載體，在雞的基因組上對AMHR2基因進行精確敲除，為研究雞AMHR2基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株、細胞系與載體 本試驗使用的DH5α、JM109感受態細胞基于Inoue方法制備[14]；HEK293T細胞、雞DF-1細胞、敲除載體原質粒pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9和SSA-RPG雙熒光報告載體原質粒pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200bp repeat.Puro-T2A-GFP保存于西北農林科技大學動物科技學院動物基因組編輯實驗室。

1.1.2 試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質粒提取試劑盒(Omega)，T4DNA連接酶與限制性內切酶(BsaI、BamH I和NotI)(NEB)，血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，Hieff TransTM脂質體核酸轉染試劑(上海翊圣生物科技有限公司)，Lipofectamine3000轉染試劑(Life Technologies)，Puromycin(Sigma-Aldrich)，pMD19-T載體(TaKaRa)，DMEM基礎培養基(Gibco)，Opti-MEM培養基(Invitrigen)。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞AMHR2基因靶位點的選擇 通過crispr.mit.edu:807網站對雞AMHR2基因的特異CDs區序列進行CRISPR/Cas9靶位點預測，根據PAM和得分，選擇位于第二外顯子上相距14 bp、GC含量分別為80%和75%(sg2-1: CTTCAGGCTGCGGCGCGCGCTGG；sg2-4: GTGGTGCGACTCCACGCCGCCGG)的成對靶位點。

1.2.2 雞AMHR2基因CRISPR/Cas9敲除載體的構建 通過Annealing PCR擬合得到靶位點序列，引物序列見表1。對pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9原載體(圖1)和靶位點擬合產物用BsaI限制性內切酶進行單酶雙切，37 ℃酶切4 h后進行膠回收純化。將純化的載體骨架與AMHR2靶位點通過T4連接酶在16℃下過夜連接。利用DH5α感受態細胞對連接產物進行轉化，在有Amp抗性的LB培養板上37 ℃培養10 h左右。用無菌10 μL透明吸頭挑取成型菌落進行菌落PCR鑒定，鑒定陽性的菌落加入2 mL有Amp抗性的液體LB培養基中，37 ℃恒溫搖床中震蕩培養10～16 h。通過質粒小提試劑盒提取菌液質粒，最終獲得雞AMHR2基因的敲除載體。提取的質粒送至生工公司進行測序分析，鑒定正確后保存于-20 ℃。

1.2.3 SSA-RPG雙熒光報告載體的構建 利用Primer Premier 6根據靶位點在雞基因組上的位置設計引物(見表1)，以雞的基因組DNA為模板擴增出包含成對靶位點的DNA序列。用NotI和BamH I分別對pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP原載體(圖2)和AMHR2靶位點擴增產物進行雙位點酶切，37 ℃酶切4 h后分別進行膠回收和溶液回收純化。后續載體構建及鑒定過程同1.2.2。

表1 載體構建引物序列Table 1 Primers for vector construction

注：小寫字母.BsaI、NotI和BamH I酶切位點；.終止密碼子。

Note: Lowercase letters.BsaI,NotI &BamH I Restriction enzyme site;.Termination codon.

1.2.4 HEK293T細胞與雞DF-1細胞的轉染 本試驗中HEK293T細胞采用DMEM基礎培養基，添加10% FBS和1% Anti-Anti，在常規細胞培養環境下培養。轉染前將HEK293T細胞傳代至24孔板中，接種密度為每孔1×105個細胞，當細胞密度達到70%左右時參照Hieff TransTM脂質體核酸轉染試劑說明書對細胞進行轉染，每個處理設置3個重復。轉染后在常規細胞培養環境下培養48 h，通過熒光倒置顯微鏡觀察細胞熒光。

DF-1細胞的培養條件與HEK293T細胞相同，轉染前將DF-1細胞傳代至12孔板中，當細胞密度達到70%～90%時用Lipofectamine3000轉染試劑進行轉染，每個處理設置3個重復。轉染后在常規細胞培養環境下培養48 h，通過熒光倒置顯微鏡觀察細胞熒光后，將培養基置換為含有3 μg/mL Puromycin的藥物篩選培養基，對敲除AMHR2基因的陽性細胞進行篩選，每天更換Puromycin藥物篩選培養基并觀察細胞狀態，藥物篩選140 h后陰性對照組DF-1細胞幾乎全部死亡而試驗組有少部分陽性細胞存活。將培養基統一更換為不含Puromycin的培養基，當DF-1細胞增殖到密度接近90%時收集細胞。利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒分別提取試驗組的DF-1細胞基因組DNA，用Nanodrop2000微量檢測儀測定濃度后于-20 ℃保存。

1.2.5 TA克隆檢測 以試驗組的DF-1細胞基因組DNA(見1.2.4)為模板，用AMHR2e2-TA-F/R引物(見表1)擴增第二外顯子上包含靶位點的564 bp片段，PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后膠回收純化。

根據pMDTM19-T Vector Cloning Kit說明書將純化的PCR產物整合到pMD19-T載體上。用JM109感受態細胞進行轉化，37 ℃培養12 h后，挑20個單克隆利用引物AMHR2e2-TA-F/R與pMD19-T載體上的通用引物M13-R進行菌落PCR，初步鑒定為陽性后用含有2 mL Amp抗性的LB液體培養基進行搖菌培養至渾濁，送至公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 雞AMHR2基因CRISPR/Cas9敲除載體的構建

通過網站預測得到位于第二外顯子上的成對雞AMHR2基因CRISPR/Cas9靶位點，相距14 bp，將退火擬合得到的2個靶位點片段分別與pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9骨架連接，構建出成對的雞AMHR2基因敲除表達載體。測序結果見圖3，表明2個雞AMHR2基因敲除表達載體均構建成功。

2.2 SSA-RPG雙熒光報告載體的構建

以pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP為骨架構建與AMHR2敲除表達載體對應的SSA-RPG雙熒光報告載體。測序結果見圖4，表明SSA-RPG雙熒光報告載體構建成功。

2.3 報告載體水平AMHR2基因敲除表達載體的工作效率

轉染后48 h的HEK293T細胞熒光觀察結果如圖5，紅光代表轉染效率，綠光代表敲除載體工作效率。陰性對照組由于敲除載體只表達Cas9而沒有引導Cas9蛋白識別靶位點的sgRNA，因此無法進行靶位點的特異切割，被轉染的細胞只有紅色熒光而沒有綠色熒光。3個試驗組相比，試驗組A的

轉染效率和靶位點敲除效率均高于試驗組B和試驗組C。因此，從報告載體水平來看成對靶位點打靶的AMHR2基因敲除效率要高于單一靶位點打靶的敲除效率，將成對敲除載體與其對應的雙熒光報告載體共轉染可以最大限度提高轉染效率和敲除載體的工作效率。

為了確定構建的敲除載體是否可以在雞的基因組上進行打靶，本試驗利用雞AMHR2基因敲除表達系統對雞DF-1細胞進行轉染。由于在HEK293T細胞上的轉染試驗結果顯示成對敲除載體與對應的報告載體共轉染可以最大限度提高轉染和敲除效率，本試驗設置了共轉染成對敲除載體和報告載體的試驗組與共轉染野生型原載體和報告載體的陰性對照組。轉染后48 h與Puromycin藥物篩選后140 h時對DF-1細胞觀察結果如圖6：試驗組被轉染的DF-1細胞有綠色熒光，且經過140 h的藥物篩選后，陰性對照組的細胞幾乎全部死亡，試驗組的轉染效率和敲除效率均有提高。

2.4 TA克隆檢測基因組水平敲除載體的工作效率

3 討 論

基因編輯是研究基因功能的重要方法之一，CRISPR/Cas9技術相較于ZFN和TALEN技術具有簡單高效的特點，自發現以來在哺乳動物上有廣泛應用[15-17]。CRISPR/Cas9技術在雞中也有成功應用但仍處于初步階段。2015年，Véron[12]對雞胚的PAX7基因進行了敲除，首次實現了在雞基因組上的編輯應用。然而，CRISPR/Cas9在雞細胞中的應用存在著靶位點突變效率低的問題[18]。Cas9核酸酶對靶位點的特異切割是基于sgRNA能夠準確識別目的基因的靶位點，但由于生物體的基因組極為復雜，sgRNA可能會與非靶位點進行錯配，導致脫靶效應[19]。因此CRISPR/Cas9系統的靶位點的設計非常重要，有研究表明sgRNA的GC含量越高，對靶位點的切割效率越高[20]。為了利用CRISPR/Cas9技術對雞的AMHR2基因進行特異敲除，首先應構建高效特異的Cas9敲除表達載體。不同于之前研究中對單一靶位點進行打靶的敲除系統，本研究通過crispr.mit.edu:807網站設計了位于雞AMHR2基因第二外顯子上的成對sgRNA靶位點，以期提高對AMHR2基因的打靶效率。

圖7 菌落PCR鑒定陽性TA克隆
1～20. PRC產物；M.DNA Marker DL2000;圖片中間的虛線表示圖片經裁剪后拼接
Fig.7 Colony PCR identified Positive TA clones
1～20. Products of PRC；M.DNA Marker DL2000;The dotted lines between lanes represent cropped images

除了選擇合適的靶位點以外，通過Puromycin藥物篩選的方式也可以大大提高經過編輯的陽性細胞率[21]。本實驗室于2016年利用自己構建的SSA-RPG雙熒光報告載體系統與stCRISPR/Cas9系統在雞DF-1細胞上實現了PPAR、ATP5E和OVA基因的成功敲除，經過Puromycin篩選后基因編輯的陽性細胞率可達95%[13]。雙熒光報告載體的工作原理如圖9所示[22]：由于靶位點的插入，Puro基因被打斷，CAG啟動子無法啟動Puro基因以及通過T2A剪切肽與其融合表達的eGFP基因，報告載體轉染細胞后只有由CMV啟動子啟動的DsRed基因表達，此時被轉染的細胞發出紅色熒光而沒有綠色熒光。當CRISPR/Cas9敲除載體工作后，對靶位點進行切割敲除，靶位點兩端的200 bp重復序列利用SSA機制對DSB進行修復，使Puro基因以及通過T2A剪切肽與其融合表達的eGFP基因能夠重新表達，此時可以觀察到細胞既有紅色熒光也有綠色熒光。因此紅色熒光即代表細胞被轉染的效率，綠色熒光代表成功敲除靶位點的效率，成功被敲除靶位點的細胞具有Puro抗性，可利用Puromycin篩選出陽性細胞。

本研究首先在報告載體水平上比較了單一靶位點敲除系統和成對靶位點敲除系統的工作效率，AMHR2基因敲除系統被分為3個試驗組和1個陰性對照組分別對HEK293T進行轉染。結果表明，成對靶位點敲除系統的工作效率高于單一靶位點敲除系統。為了更準確地檢測CRISPR/Cas9敲除系統在雞的基因組水平上對AMHR2基因的敲除效率，后續試驗采用成對雞AMHR2基因敲除表達載體和對應SSA-RPG報告載體對DF-1細胞進行共轉染，轉染48 h后添加Puromycin進行藥物篩選富集陽性細胞并提取基因組DNA。為了進一步檢測CRISPR/Cas9敲除系統的工作效率，本研究進行了TA克隆并挑取陽性菌落進行測序分析。測序結果表明，DF-1細胞基因組中AMHR2基因的突變率為60.0%，基因突變類型為堿基缺失，表明CRISPR/Cas9系統能夠成功對雞基因組上的AMHR2基因進行特異敲除，但工作效率不高仍需進行試驗改進。

4 結 論

本研究構建了靶向雞AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系統，在雞DF-1細胞的基因組上對AMHR2基因進行了成功敲除(約60%)，為雞AMHR2基因的功能研究奠定了基礎。