射干麻黃湯對急性呼吸衰竭模型大鼠的干預效果及作用機制研究?

陳永昶 林 利 茆俊卿 王 謙 朱 佳△

（1.南京中醫藥大學揚州附屬醫院，江蘇 揚州 225000；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京210000；3.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210000）

急性呼吸衰竭主要是指機體肺功能、換氣功能出現嚴重異?；蚬δ苷系K，導致機體氣體交換無法正常進行，進而導致機體生理功能異常以及代謝紊亂的癥狀[1-2]。隨著我國人口老齡化現象的不斷發展以及我國環境污染問題的日益嚴重，近年來我國急性呼吸衰竭發病率逐年上升，嚴重威脅患者的身體健康和生活質量，因此尋找一種安全有效的治療手段具有重要意義[3-4]。射干麻黃湯常用于呼吸系統疾病的治療，但是關于其治療急性呼吸衰竭的臨床研究還鮮有報道。本研究中建立急性呼吸衰竭大鼠模型，使用射干麻黃湯進行干預，旨在探究射干麻黃湯對急性呼吸衰竭模型大鼠的干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取40只SD健康雄性大鼠，由基爾頓生物科技（上海）有限公司提供，平均月齡（8.9±0.5）月，平均體質量（230.2±10.3）g。在相對濕度30%～35%、溫度（23.8±1.5）℃的環境中喂養大鼠1周，光照12 h/d。本研究獲我院倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 射干麻黃湯：射干、麻黃、五味子、桔梗、款冬花、紫菀各12 g，黨參、制半夏、細辛、生姜各9 g，黃芪30 g，大棗5枚。藥材購于本院中藥房，將藥材于清水中浸泡30 min，加水后使用文火煎90 min，濃縮為1 mL含生藥3.84 g的藥汁。脂多糖（上海鼓臣生物技術有限公司）；兔抗大鼠白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-17（IL-17）抗體（Sigma公司）；兔抗小鼠超敏C反應蛋白（hs-CRP）抗體（Dako公司）；小鼠抗大鼠GSH-Px抗體（Invitrogen公司）；兔抗小鼠過氧化脂（LPO）抗體（Selleck公司）；大鼠抗小鼠丙二醛（MDA）抗體（Hyclone公司）；大鼠抗兔Bcl-2、Bax抗體（Gibco公司）；小鼠抗兔Caspase3抗體（BD公司）。硫酸阿托品注射液（成都第一藥業有限公司）；動物肺功能儀（上海玉研科學儀器有限公司）；冰凍切片機（湖北孝感闊海醫療科技有限公司）；血氣分析儀（北京普朗新技術有限公司）。

1.3 模型制備 參照耿維鳳等[5]建模方法，隨機選取30只大鼠建立急性呼吸衰竭模型：麻醉后將其在操作臺上固定，將大鼠支氣管暴露于術野之中，并進行插管處理，之后將5 mg/kg大腸桿菌脂多糖滴入支氣管中，并根據血氣分析結果確定建模成功情況：動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）<35 mmHg、動脈血氧分壓（PaO2）<75 mmHg可判定為建模成功。建模過程中死亡1只，建模失敗3只，建模成功26只。

1.4 分組與給藥 將26只急性呼吸衰竭大鼠隨機分為模型組8只及西藥組、射干麻黃湯組各9只，其余10只未作處理大鼠為正常組。正常組、模型組大鼠使用3 mL 0.9%氯化鈉注射液進行灌胃處理；西藥組大鼠腹腔注射0.1 mL硫酸阿托品注射液，每日1次；射干麻黃湯組大鼠灌胃射干麻黃湯，每日1次，每次3 mL。各組大鼠均連續干預7 d。

1.5 呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平檢測 連續干預7 d后使用動物肺功能儀對各組大鼠呼吸頻率進行統計，使用血氣分析儀對各組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平進行檢測。

1.6 標本采集與檢測 1）肺組織病理學觀察。血氣指標檢測結束后，采用斷頭法處死大鼠，取肺組織，置于冰凍切片機上進行包埋處理，-26℃冷凍處理2.5 h后切片，厚度為10 μm，切片置于-20℃下保存。將切片烤干后進行脫蠟處理，置入不同濃度酒精中復水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，酒精脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。2）酶聯免疫吸附實驗法檢測IL-8、IL-17、hs-CRP水平。干預7 d后，取各組大鼠尾部靜脈血2 mL，2 000 r/min離心15 min，分離上清液，于-80℃保存。使用酶標儀檢測A450值，分析IL-8、IL-17、hs-CRP水平。3）免疫透射比濁法檢測GSH-Px、LPO、MDA水平。取已制備血清標本，準備3個試管并分別標記為標準管、測定管及空白管，3個試管中均加入350 μL緩沖液，標準管中加入20 μL GSH-Px、LPO、MDA標準液，測定管中加入20 μL血清，空白管中加入20 μL蒸餾水，3個試管分別搖晃均勻，常溫環境靜置5～10 min后使用分光光度計進行比色，在500 nm波長處以空白管調零，記錄吸光度，對GSH-Px、LPO、MDA水平進行計算。4）Western blotting法檢測Bcl-2、Bax、Caspase3表達。取已制備好的肺組織切片標本，使用PBS緩沖液對標本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。按20 μg/孔添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環境下封閉90 min。之后結合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對Bcl-2、Bax、Cas?pase3表達進行檢測。

1.7 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平比較見表1。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠呼吸頻率顯著低于正常組，西藥組、射干麻黃湯組大鼠呼吸頻率高于模型組，且射干麻黃湯組大鼠呼吸頻率高于西藥組（均P＜0.05）；模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平顯著低于正常組，西藥組、射干麻黃湯組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平高于模型組，且射干麻黃湯組大鼠pH、PaCO2、PaO2水平高于西藥組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平比較（±s）

表1 各組大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平比較（±s）

與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 1093.8 39.9 79.986.呼吸頻率（次/min）35±6.58 11±3.06*12±5.62*#22±6.01*#△pH 7.40±0.11 7.03±0.06*7.18±0.07*#7.29±0.09*#△PaCO2（mmHg）43.02±2.19 30.26±1.35*38.51±1.62*#41.12±1.95*#△PaO2（mmHg）81.67±3.26 53.26±2.34*65.99±2.87*#74.66±3.12*#△

2.2 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較 見表2。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平高于正常組（P＜0.05）；西藥組、射干麻黃湯組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平低于模型組，且射干麻黃湯組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平低于西藥組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較（±s）

表2 各組大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平比較（±s）

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 102 8 6 9 3 93 IL-8（pg/mL）6.35±3.12 2.29±5.98*5.09±4.12*#1.22±3.61*#△IL-17（ng/L）8.26±1.42 27.51±3.42*13.97±2.13*#11.59±1.98*#△hs-CRP（ng/mL）4.11±0.71 13.25±2.46*8.22±1.23*#6.15±0.85*#△

2.3 各組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較 見表3。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠GSH-Px水平低于正常組，LPO、MDA水平高于正常組（P＜0.05）；西藥組、射干麻黃湯組大鼠GSH-Px水平高于模型組，LPO、MDA水平低于模型組，且射干麻黃湯組大鼠GSH-Px水平高于西藥組，LPO、MDA水平低于西藥組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較（±s）

表3 各組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較（±s）

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 1081.5 8 52.3 9 65.1 973.5 GSH-Px（U/L）2±7.66 9±4.60*1±5.72*#1±6.97*#△LPO（U/mg）0.06±0.01 0.22±0.05*0.13±0.02*#0.08±0.01*#△MDA（μmol/L）19.56±2.08 37.30±3.72*27.59±2.67*#23.51±2.32*#△

2.4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表達比較 見表4、圖1。模型組、西藥組、射干麻黃湯組大鼠Bcl-2、Caspase3表達均高于正常組，Bax表達低于正常組（P＜0.05）；西藥組、射干麻黃湯組大鼠Bcl-2、Caspase3表達均低于模型組，Bax表達均高于模型組，且射干麻黃湯組大鼠Bcl-2、Caspase3表達低于西藥組，Bax表達高于西藥組（P＜0.05）。

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表達比較（±s）

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase3表達比較（±s）

組別正常組模型組西藥組射干麻黃湯組n 10 8 9 9 Bcl-2 0.96±0.13 1.68±0.31*1.32±0.18*#1.10±0.15*#△Bax 1.20±0.16 0.41±0.03*0.88±0.09*#1.05±0.12*#△Caspase3 1.06±0.10 1.73±0.29*1.34±0.17*#1.19±0.12*#△

圖1 各組Bcl-2、Bax、Caspase3表達條帶

2.5 各組大鼠肺組織病理學觀察 見圖2。正常組肺泡大小均勻、結構完整，肺泡間隔一致，無增厚現象；支氣管上皮組織未出現炎性細胞浸潤現象。模型組肺泡間隔增加，肺泡毛細血管壁發現充血，有炎性細胞浸潤，有部分肺泡出現水腫。射干麻黃湯組肺泡腔內干凈，細胞間隔未見增厚，炎性細胞浸潤程度明顯下降，未見肺泡水腫、毛細血管充血情況。

圖2 各組大鼠肺組織病理學觀察圖（HE染色，100倍）

3 討論

目前臨床常使用西醫治療手段對急性呼吸衰竭患者進行治療，但是臨床治療效果并不理想，因此大多數專家學者開始致力于中醫藥治療急性呼吸衰竭的研究[6]。中醫學將急性呼吸衰竭癥狀歸于“肺脹”范疇，主要表現為肺氣虧虛。射干麻黃湯由射干、麻黃、黨參、黃芪、五味子、桔梗、款冬花、生姜等組成。射干、麻黃具有開郁、宣肺、化痰、平喘的功效；黨參、黃芪等具有滋陰、潤肺、益氣的功效；以五味子、桔梗、款冬花、生姜等相佐，能夠起到較為理想的健脾、宣肺、益氣、平喘、化痰的功效[7-8]。

急性呼吸衰竭癥狀的發生發展會使機體pH、PaCO2、PaO2等血氣指標水平出現明顯的異常，對pH、PaCO2、PaO2水平進行檢測，能夠對急性呼吸衰竭癥狀嚴重程度以及臨床治療效果進行較為準確的評價[9-10]。本研究結果顯示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠呼吸頻率以及pH、PaCO2、PaO2水平較低，使用射干麻黃湯對急性呼吸衰竭大鼠進行干預，大鼠呼吸頻率及pH、PaCO2、PaO2水平明顯上升而趨于正常水平，說明使用射干麻黃湯進行干預能夠改善急性呼吸衰竭大鼠呼吸功能及血氣指標水平。

大量實驗研究表明，急性呼吸衰竭癥狀的發生發展伴隨著機體炎癥反應[11-12]。IL-8、IL-17、hs-CRP是廣譜的炎性指標。IL-8能夠吸引、激活中性粒細胞，誘發機體局部炎癥反應，對機體組織細胞造成損傷[13]。IL-17是一種致炎因子，由活化的T細胞產生，能夠促進IL-6、IL-8等炎癥因子的生成，進而誘發炎癥反應[14]。hs-CRP主要由肝臟組織合成，是一種廣譜的機體炎癥反應標志物[15]。本研究結果顯示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠IL-8、IL-17、hs-CRP水平明顯較高，說明急性呼吸衰竭大鼠肺組織存在較為嚴重的炎癥反應。使用射干麻黃湯進行干預后IL-8、IL-17、hs-CRP水平明顯下降，說明射干麻黃湯干預能夠抑制IL-8、IL-17、hs-CRP水平，減輕大鼠肺組織炎癥反應，從而起到肺保護作用。

呼吸衰竭癥狀的發生發展與機體氧化應激損傷具有密切聯系[16-17]。GSH-Px、LPO、MDA是臨床較為常用的評價機體抗氧化能力的指標，其表達水平的變化與機體氧化應激損傷嚴重程度密切相關。本研究結果顯示，相比正常大鼠，急性呼吸衰竭大鼠GSH-Px水平較低，LPO、MDA水平較高，說明急性呼吸衰竭癥狀的發生發展伴隨著肺組織細胞氧化應激損傷，使用射干麻黃湯進行干預的急性呼吸衰竭大鼠GSH-Px水平上升，LPO、MDA水平下降，說明射干麻黃湯能夠調控GSH-Px、LPO、MDA水平，減輕大鼠肺組織氧化應激損傷，從而起到較為理想的肺保護作用。

呼吸衰竭癥狀的發生發展與機體肺組織細胞凋亡密切相關。Bcl-2、Bax、Caspase3表達的變化與細胞凋亡能力密切相關。Bcl-2、Bax是線粒體細胞凋亡通路中的重要基因，二者表達水平的變化與細胞凋亡密切相關[18-19]。Caspase家族與細胞凋亡密切相關，Cas?pase3是Caspase家族的重要一員[20]。本研究結果顯示，使用射干麻黃湯對急性呼吸衰竭大鼠進行干預，Bcl-2、Caspase3表達出現下調，Bax表達出現上調，說明射干麻黃湯能夠調控Bcl-2、Bax、Caspase3表達，抑制急性呼吸衰竭大鼠肺組織細胞凋亡，從而起到肺保護作用。

綜上所述，使用射干麻黃湯對急性呼吸衰竭大鼠進行干預，能夠改善大鼠呼吸頻次及血氣水平，減輕大鼠炎癥反應及氧化應激損傷，抑制肺組織細胞凋亡，從而起到一定的肺保護作用，為急性呼吸衰竭的臨床治療提供參考依據。