小麥Pinb基因啟動子區CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建

張淑娟 張榮志 宋國琦 李玉蓮 高潔 李瑋 高世慶 李根英

摘要：CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術已經逐漸成熟并在多種植物中得到成功應用，促進了基因功能的研究。小麥籽粒硬度是決定小麥加工品質的重要性狀，Pinb是控制籽粒硬度的關鍵基因之一。本研究以小麥Pinb基因為對象，聯合采用常規PCR和Golden Gate cloning技術，構建了包含小麥Pinb基因啟動子區雙靶點的CRISPR/Cas9基因編輯載體。將重組載體轉入小麥原生質體中進行sgRNA活性的檢測，在兩個靶點位置均發生了突變，編輯效率分別為4.57%和4.37%，基因編輯類型包括堿基替換和堿基缺失。該研究為在小麥中實現Pinb基因的定點突變奠定了基礎，對其功能研究和小麥品質改良均具有重要意義。

關鍵詞：小麥;CRISPR/Cas9;基因編輯;Pinb基因

中圖分類號：S512.103.53：Q782 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）01-0001-09

Abstract The genome editing technology system mediated by CRISPR/Cas9 has ripen and successfully applied in many plants， which promotes the study of gene function. Hardness of wheat grain is an important trait for determining the quality of wheat processing. The Pinb gene is one of the key genes controlling grain hardness. In the study， we chose the Pinb gene of wheat as research object， and constructed a CRISPR/Cas9 genome editing vector containing dual targets in the Pinb gene promoter region of wheat by conventional PCR and Golden Gate cloning technology. Then we transferred the recombinant vector into wheat protoplast and detected the activity of sgRNA. We found the dual targets position had mutated， and the gene editing types included base substitution and base deletion， and the corresponding editing efficiencies were 4.57% and 4.37%， respectively. The results laid the foundation for realizing the site-directed mutagenesis of the Pinb gene， which was of great significance for the functional study of Pinb gene and the improvement of wheat quality.

Keywords Wheat; CRISPR/Cas9; Gene editing; Pinb gene

CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9）作為一種新興的基因編輯系統，具有載體構建相對簡單、靶向特異性高、可以多處打靶等特點，在基因功能研究方面逐漸成熟并成功應用于多種動植物。其原理是crRNA與tracrRNA通過堿基配對結合形成crRNA/tracrRNA復合體（可以人工設計改造這兩種RNA，形成單個具有引導作用的sgRNA），引導Cas9蛋白在與crRNA配對靶位點處形成雙鏈斷裂（double-stranded DNA breaks，DSBs），之后細胞可以通過非同源性末端接合（non-homologous end jouning，NHEJ）修復機制實現基因組特定位點的DNA插入、缺失、堿基突變或修飾，從而使基因發生移碼突變。另外，還可以通過同源重組等方式進行精準基因編輯。

目前植物CRISPR/Cas9系統日趨完善，已經在多個物種中成功實現了定點基因組編輯，除在擬南芥[1，2]、煙草[1，3]等模式植物上獲得成功，在水稻[4-8]、大豆[9-11]、高粱[1]、玉米[12-15]、番茄[16]、大麥[17]、甜橙[18]、西瓜[19]、葡萄[20]、小麥[21-24]等農作物上也成功實現了CRISPR/Cas9的應用。普通小麥 （Triticum aestivum L.） 是世界上種植面積最廣的作物之一，具有非常復雜的多倍體基因組（17 Gb）和高比例的重復序列（>80%），為小麥遺傳和功能分析帶來了挑戰。目前，在普通小麥中只有少數使用CRISPR/Cas9進行基因編輯的報道。由CRISPR/Cas9系統獲得的TaMLO突變體具有對白粉病的廣譜抗性[22]。 Zhang等[25]將CRISPR/Cas9編輯方法用于六倍體面包小麥和四倍體硬粒小麥，產生的突變體沒有任何可檢出的轉基因。Zhang等[26]利用CRISPR/Cas9系統同時敲除小麥EDR1基因的三個同源基因，獲得的植株對白粉病具有很好的抗性。另外，利用CRISPR/Cas9技術可以有效地減少小麥籽粒中α-醇溶蛋白含量，從而為谷蛋白不耐受的消費者提供特殊面包和硬質小麥系列[23]。

籽粒硬度（grain hardness）是重要的小麥品質性狀之一，對谷物加工品質具有重要影響。小麥籽粒硬度主要由位于5D染色體短臂上的2個主效基因Pina（Puroindoline a）和Pinb（Puroindoline b）調控，并受Gsp-1基因（Grain Softness Protein）的影響。Pina和Pinb緊密連鎖，編碼區均為447 bp，沒有內含子，共同形成小麥籽粒硬度的分子遺傳基礎。Pina和Pinb基因的突變或缺失均會引起小麥胚乳質地的硬度增加。盡管二倍體小麥祖先種A和B中存在Pina和Pinb基因，但是四倍體馴化小麥中卻不存在這兩個基因，所以表現出硬粒表型。而六倍體小麥由于D組的加入，重新獲得了Pina和Pinb，故而表現出籽粒硬度的多樣性。所以小麥的硬度基因位點從一定程度上反映了小麥的進化和馴化過程。

目前，關于小麥硬度基因表達調控的研究較少。小麥Pina和Pinb基因的啟動子已經分離出來，且有關于啟動子組成的分析，但是在啟動子調控方面并沒有相關數據。使用CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯農作物相關基因的啟動子，可對作物數量性狀產生微妙的影響。Rodriguez-Leal等[27]利用CRISPR/Cas9體系改良番茄數量性狀，通過定點修飾順式調控序列實現對數量性狀的精準調控。挖掘和創制順式調控序列的變異，對于作物遺傳改良意義重大。

利用CRISPR/Cas9突變相關基因的啟動子而不是這些基因本身，能夠實現對數量性狀的精細調節，微調基因表達而不是剔除或滅活它們編碼的蛋白。本研究擬對TaPinb基因的啟動子區域進行基因編輯，目的在于進一步明確TaPinb基因的功能和其在籽粒質地形成中的作用，并為通過基因工程方法快速改良我國現有小麥優良品種的籽粒硬度提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物CRISPR/Cas9基因編輯載體為pYLCRISPR/Cas9PubiB，GenBank登錄號為KR029110.1，它是在雙元載體pCAMBIA1300（AF234296）的基礎上改造而來的，Cas9p模擬了禾本科植物基因具有5′端GC含量較高的特征，是設計合成的植物優化密碼子基因。sgRNA的載體pYPQ131D-TaU6和pYPQ132C-TaU6是CRISPR/Cas9基因編輯載體的中間載體，均含有小麥U6啟動子TaU6，用以啟動sgRNA。以上質粒均由本實驗室保存。

T4連接酶、DNA Marker DL2000等試劑購自TaKaRa公司;FastPfu、2×Taq Mix、DH5α等購自北京全式金公司;限制性內切酶BgⅢ、BsmBⅠ等購自Fermentas公司;BsaⅠ-HF購自NEB公司;引物由青島擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.2 表達載體的構建

1.2.1 Pinb基因的擴增和sgRNA的選擇 以Pinb-F和Pinb-R為引物，以小麥品種Fielder的基因組DNA為模板，用高保真酶擴增Pinb基因，PCR體系為：5×buffer 10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，FastPfu 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，加水補齊至50 μL。程序為：95℃ 2 min;95℃ 20 s，56℃ 50 s，72℃ 30 s，33個循環;72℃ 5 min。電泳切膠回收，連接載體，送測序公司測序。

通過網站CRISPRdirect （http：//crispr.dbcls.jp/）在TaPinb基因ATG前的啟動子區域尋找2個適合的打靶位點，在PAM結構前選擇合適的序列片段設定為靶序列，分別為：sgRNA1：5′-ATGTCACTAAGCAATAAATAA-3′;sgRNA2：5′-GGAGATGAATAGATGGGTTG-3′。

1.2.2 sgRNA表達盒構建方法

（1）線性化克隆載體pYPQ131D、pYPQ132C：使用限制性內切酶BgⅢ和BsmBⅠ雙酶切克隆載體pYPQ131D-TaU6、pYPQ132C-TaU6，37℃溫育1 h，電泳后利用DNA回收試劑盒回收3.5 kb的線性化片段，定量后備用。

（2）引物磷酸化退火形成雙鏈：Pinb基因的sgRNA1的引物對應的是Pinb-TaU6-gR1F和Pinb-TaU6-gR1R（表1），sgRNA2的引物對應的是Pinb-TaU6-gR2F和Pinb-TaU6-gR2R（表1），引物中的下劃線堿基部分分別與pYPQ131D和pYPQ132C載體中的序列匹配。分別將sgRNA1和sgRNA2的2條引物進行磷酸化，直接退火形成雙鏈，程序在PCR儀中按下列條件運行：37℃ 30 min，95℃ 5 min，5℃/min （0.08℃/s）的速度將溫度降至25℃?；蛘呤欠兴兄? min，之后自然冷卻至室溫。

（3） 連接轉化：將上述線性化的克隆載體pYPQ131D、pYPQ132C，和磷酸化后的寡核苷酸鏈sgRNA1和sgRNA2分別在16℃過夜連接，轉化DH5α，平板四環素抗性。之后挑平板單克隆送測序，驗證是否插入，最終得到pYPQ131D-gR1和pYPQ132C-gR2。

1.2.3 組裝sgRNA表達盒到pYLCRISPR/Cas9載體

（1）sgRNA表達盒的擴增：以上述試驗中獲得的pYPQ131D-gR1和pYPQ132C-gR2為模板，分別以YL-131D-F和YL-131D-R、YL-132C-F和YL-132C-R為引物，用高保真酶擴增TaU6-gR1和TaU6-gR2這2個表達盒，PCR體系為：5×buffer 10 μL，dNTP（2.5 mmol/L）5 μL，FastPfu 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，加水補齊至50 μL。程序為：95℃ 2 min; 95℃ 20 s，62℃ 20 s，72℃ 30 s，33個循環;72℃ 5 min。電泳切膠回收，定量備用。

（2） pYLCRISPR/Cas9載體與sgRNA表達盒的酶切連接反應：利用Golden Gate cloning的方法，將pYPQ131D-sgRNA1和pYPQ132C-sgRNA2這兩個表達盒克隆到pYLCRISPR/Cas9載體中。連接用的2個表達盒即上述步驟中的TaU6-gR1和TaU6-gR2。酶切連接反應體系為：10×Cutsmart Buffer 1 μL ，10 mmol/L ATP 1 μL ，TaU6-gR1 1 μL，TaU6-gR2 1 μL，pYLCRISPR/Cas9Pubi-B 2 μL，BsaⅠ-HF 1 μL，T4 ligase 1 μL，ddH2O補足10 μL。用變溫循環進行酶切連接約10～15循環： 37℃ 5 min， 10℃ 5 min， 20℃ 5 min;最后37℃ 5 min。

（3）連接轉化：將連接產物轉化大腸桿菌，重組質粒經轉化到DH5α感受態細胞，之后于LB（Kan）平板上培養至克隆長出后，挑單克隆進行菌液PCR鑒定及測序。引物用的是SP-L1和SP-R。

1.3 小麥原生質體的提取和轉化

參照文獻[28]的小麥原生質體制備及轉化方法并適當調整。種子在25℃（16L/8D）培養條件下生長7～10 d。取15～20片新鮮葉片用手術刀片切成0.5～1.0 mm寬的細條并轉移到10 mL酶解液（1.5%纖維素酶R10，0.75%離析酶，0.6 mol/L甘露醇，20 mmol/L MES，10 mmol/L KCl，10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA）。將酶解液和葉條置于50 r/min搖床上，用錫箔紙包裹在黑暗條件下酶解6 h。酶解后，加入等體積W5（2 mmol/L MES， 154 mmol/L NaCl， 125 mmol/L CaCl2， 5 mmol/L KCl） 輕柔搖晃釋放出原生質體，清洗3次。用70 μm的細胞網篩過濾酶解液，用50 mL圓底離心管收集濾液。加入MMG溶液重懸（0.4 mol/L mannitol， 15 mmol/L MgCl2， 4 mmol/L MES）。將構建好的質粒利用PEG介導的方法轉化入原生質體。最后，黑暗或者弱光下25℃培養原生質體2～3 d。離心后收集小麥原生質體，用DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA。

1.4 基因編輯結果檢測

使用特異性引物對靶位點區域進行擴增。將正向和反向的Barcode分別添加到PCR引物的5′端用于文庫構建（引物為表1中的PF和PR，下劃線為Barcode）。通過具有相應Barcode的引物擴增對應于Pinb基因2個靶位點的區域。擴增后，將等量的PCR產物混合，按照German等[29]的方法構建2×150 bp paired-end 文庫，用于諾禾致源公司進行Illumina測序。在靶基因的靶向位點處發生的InDel（包括替換、插入和缺失）被認為是突變。

2 結果與分析

2.1 靶向TaPinb的sgRNA設計

從小麥品種Fielder里擴增TaPinb基因的序列，擴增序列見圖1，與NCBI數據庫中該基因序藍色代表TaPinb基因的編碼區，下劃線標記序列為靶向TaPinb基因的兩個sgRNA序列。

圖1 TaPinb基因及sgRNA序列列100%相似。TaPinb基因全長447個堿基，沒有內含子，應用軟件CRISPRdirect在TaPinb基因ATG前的啟動子區域找到兩個合適的sgRNA，分別為：sgRNA1：5′-ATGTCACTAAGCAATAAATAA-3′;sgRNA2：5′-GGAGATGAATAGATGGGTTG-3′。

2.2 sgRNA連接到pYPQ31D和pYPQ132C

分別將sgRNA1和sgRNA2的2條引物進行磷酸化，直接退火形成雙鏈，然后分別與用限制性內切酶BgⅢ和BsmBⅠ雙酶切后的克隆載體pYPQ131D-TaU6、pYPQ132C-TaU6連接轉化，測序結果見圖2。

2.3 TaPinb的sgRNA表達盒的擴增

以pYPQ131D-gR1和pYPQ132C-gR2為模板，分別以YL-131D-F和YL-131D-R、YL-132C-F和YL-132C-R為引物，用高保真酶擴增TaU6-gR1和TaU6-gR2這2個表達盒，擴增產物大小為571 bp（圖3）。

2.4 sgRNA表達盒和Cas9雙元表達載體的組合

我們應用Golden Gate cloning技術，一步完成sgRNA表達盒的拼接及與Cas9雙元表達載體的組合，從而獲得CRISPR/Cas9編輯載體（圖4）。如圖5所示，用SP-L1和SP-R進行PCR擴增，可見約1.5 kb的條帶，包括2個sgRNA表達盒的大?。═aU6-sgRNA），與預期相符，而對照pYLCRISPR/Cas9Pubi-B雙元表達載體擴增出的條帶是ccdB，約657 bp，這說明sgRNA1和sgRNA2表達盒已經組裝進入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B雙元表達載體，獲得了TaPinb的CRISPR/Cas9基因編輯載體。

為了進一步驗證TaPinb的CRISPR/Cas9基因編輯載體是否構建成功，我們將獲得的質粒送測序公司進行測序，引物用的是SP-L1和SP-R，結果檢測到了2個sgRNA的靶序列，同時在靶序列上游都檢測到了TaU6啟動子序列，說明sgRNA1和sgRNA2表達盒構建成功，并成功地組裝進入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B雙元表達載體，證明了Pinb的CRISPR/Cas9基因編輯載體構建成功（圖6）。

采用PEG法轉化小麥原生質體，將轉化后孵育2～3 d的小麥原生質體用植物基因組DNA提取試劑盒提取小麥基因組DNA，對靶位點進行擴增后建庫測序。測序結果表明目標的編輯類型主要是SNP和InDel。其中，Pinb-gR1位點具有4.57%的突變效率，包括4.49%的SNP和0.08%的InDel。Pinb-gR2位點的突變效率4.37%，包括4.05%的SNP和0.33%的InDel（表2）。Pinb-gR1突變位點檢測（圖7a）發現編輯位點（PAM序列前第4位）處有堿基的替換和缺失，包括單堿基的替換、單堿基的缺失以及4個堿基的缺失。Pinb-gR2突變位點檢測結果見圖7b，突變類型主要是單堿基替換和缺失，另外，在PAM前的其它位點也檢測到了突變。

3 討論與結論

普通小麥是世界上種植面積最廣的作物之一，籽粒硬度是決定小麥加工品質最重要的性狀之一，對小麥出粉率、淀粉損傷和生面粉團的吸水性都具有較大影響。因此Pin基因的功能研究和轉基因應用對小麥品質改良理論與實踐具有重要意義，為進一步研究小麥中Pin基因在影響籽粒硬度的分子機理奠定基礎，為選育優質專用小麥提供種質資源。

基因敲除是研究基因功能最簡單的方法之一。CRISPR/Cas9系統能夠誘導基因組產生雙鏈斷裂，通過細胞自身的NHEJ修復途徑造成若干堿基的插入、缺失和替換，從而造成基因的移碼突變，起到基因敲除的作用。目前植物CRISPR/Cas9系統已日趨完善，已經在多種植物中成功實現了定點基因組編輯。

為了探索CRISPR/Cas9系統應用于小麥基因組編輯的效率和特異性，本研究針對Pinb基因的啟動子區設計了兩個sgRNA。本載體系統可采用Golden Gate cloning技術[30]， 其原理是利用BsaⅠ（type Ⅱs restriction enzyme）的識別位點和切割位點不重疊的特性，可以設計出多種不同的且非回文結構的粘性末端。多個要連接的片段在連接點具有特異的互補末端可以連接，而非連接點的末端之間不互補不能連接（相同末端分子間也不互補不能連接），因此連接反應是向著目標單方向進行，效率很高。

我們通過PEG介導的原生質體轉化方法將構建好的CRISPR/Cas9植物表達載體轉入小麥的原生質體，Illumina測序結果顯示CRISPR/Cas9系統在小麥原生質體中進行了Pinb基因編輯。在兩個靶位點均檢測到了堿基的突變，編輯效率分別為4.57%和4.37%，其中多數情況是堿基替換，少數情況是堿基的刪除。另外，在小麥原生質體編輯情況檢測中發現除了PAM序列前第四個堿基處發生突變外，在gRNA靶標區域的其它堿基處也發現了一些突變，這可能是由于原生質體DNA制備過程有損傷，導致測序出現個別堿基的差異。有研究表明CRISPR/Cas9的特異性僅與gRNA配對的靠近PAM處7～12 bp堿基相關，其它堿基的突變是否與Cas9的特異性有關也需要在轉基因小麥中進一步驗證。

本研究通過PEG介導的方法將構建好的CRISPR/Cas9基因編輯載體轉入小麥原生質體，利用高通量測序檢測到了靶標基因的編輯，證明該載體可以應用于小麥的基因組編輯，從而為應用CRISPR/Cas9系統獲得小麥基因組編輯植株打下堅實的基礎。目前我們正在將這個載體進行農桿菌介導的小麥遺傳轉化，下一步將會在轉基因小麥植株中檢測編輯類型。

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