亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的影響

馬楊君，崔 凱，鄒 琦，李和平*

（1.東北林業大學 野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040；2.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

1951年，美籍華人張明覺（Chang M C）［1］和澳大利亞科學家C.R.Austin［2］幾乎同時發現，哺乳動物精子必須在雌性生殖道內經歷一段成熟過程才能獲得受精能力。1952年，C.R.Austin將這一現象稱之為精子獲能（capacitation）。精子獲能現象的發現被認為是體外受精史上的一個里程碑。精子在受精前必須獲能，這是哺乳動物獨具的特性。因此精子體外誘導獲能是體外受精研究中必須首先解決的問題之一。

亞?；撬崾蔷哂袕V泛生理活性的物質。L.E.Cornett等［3］和R.L.Mrsny等［4］最早發現，金黃地鼠精子在體外培養基中會很快死亡，但加入亞?；撬岷笄闆r獲得改善，存活時間顯著延長，為精子的體外獲能與受精創造了條件。

鹿是重要的經濟動物，開展其受精生物學研究同樣具有重要科學意義，但目前有關亞?；撬釋ζ渚芋w外獲能的研究很少。本研究以馬鹿為試驗對象，開展了亞?；撬釋β咕芋w外獲能影響的研究，以期為亞?；撬嵩诼贵w外受精實踐中提供基礎的數據參考。

1 材料方法

1.1 精液來源

馬鹿新鮮精液，以人工采精的方法采自同一頭成年健康種公鹿。采得的新鮮精液用稀釋液稀釋后，于0.25 mL細管中分裝，0～4℃保存（不超過5 d）。

1.2 試劑

Hypotaurine、BSA、肝素、Penicillin G、Streptomycin sulfate、NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4、Na-Pyruvate、NaHCO3、Glucose、臺盼藍，均購自SIGMA公司；DMSO，AMRESCO 分裝；Phenol Red，購自ALDRICH公司；俾士麥棕Y，購自CHROMA公司；玫瑰紅B、戊二醛、乙醇，均為國產分析純。

1.3 精子體外獲能培養液

BO／TALP基礎液按照細胞培養用液的要求配制。洗精液為BO／TALP基礎液+6 mg／mL BSA，獲能液為BO／TALP基礎液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素。溶液均在使用前配制，0.22μm濾器過濾除菌后，于CO2培養箱中平衡4 h以上使用。各種培養液均采用滅菌超純水配制。

1.4 試驗方案

采用上浮法，在獲能液BO／TALP基礎液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素中，分別添加亞?；撬嶂两K濃度為0，30，50，70，100，200μmol／L的濃度梯度，處理45 min，觀測體外獲能效果；并隨之制作培養滴，在培養箱中培養，于2，4，6，8 h后鏡檢，記錄精子活率，計算彎尾率。

2 結果

2.1 BO液中亞?；撬釋荧@能的影響

見表1。

表1 BO液中不同濃度亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的影響

在BO液中使用不同濃度亞?；撬?，隨著亞?；撬釢舛鹊脑黾?，精子活力、彎尾率逐漸提高。各添加組精子活力、彎尾率均顯著高于不添加組（P＜0.05）。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子活力最高，但與亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組差異不顯著（P＞0.05），即亞?；撬釢舛葹?00，200μmol／L的兩個添加組精子活力相當。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子彎尾率最高，顯著高于其他添加組（P＜0.05）。

2.2 TALP液中亞?；撬釋荧@能的影響

見表2。

表2 TALP液中不同濃度亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的影響

在TALP液中使用不同濃度亞?；撬?，各添加組精子活力、彎尾率均顯著高于不添加組（P＜0.05）。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子活力最高，但與亞?；撬釢舛葹?0μmol／L、100μmol／L的兩組差異不顯著（P＞0.05），即亞?；撬釢舛葹?0，100，200μmol／L的三組精子活力相當。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子彎尾率最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.3 時間與亞?；撬釋踊盥实挠绊?/h3>

2.3.1 BO液中亞?；撬釋踊盥实挠绊?見表3。

在BO液中添加不同濃度亞?；撬峥筛纳凭踊盥?，2～8 h期間精子活率均高于不添組，即添加亞?；撬峥煽s減精子活率的降低、延緩精子活率的降低速度。

2.3.2 TALP液中亞?；撬釋踊盥实挠绊?見表4。

表4 TALP液中亞?；撬釋踊盥实挠绊?/p>

在TALP液中添加不同濃度亞?；撬釋踊盥实挠绊懶Ч?、趨勢與在BO液中的效果相似，但亞?；撬嵩赥ALP液中的效果總體優于在BO液中的效果。

3 討論

精子獲能是所有哺乳動物精子受精前必須經歷的一個生理階段［2］。早期人們采用精子體內獲能的方法，從交配母獸的子宮中沖取獲能精子，再與卵子在體外實現受精［5］。但是體內獲能常常受到很多條件的限制，為此亟待發展一種體外獲能的方法。于是研究者便使用各種動物的體液（如輸卵管液、濾泡液和血清）使精子在體外獲能［6］，但這些體液成分相當復雜，很難確定何種成分參與誘發或支持精子獲能。1971年Y.Toyoda等［7］最先采用了一種特定的活性培養基使精子獲能并成功完成體外受精，自此分析體外精子獲能成為比較容易的事情。體外獲能技術可以較好地控制試驗條件，并可逐個分析獲能相關因子。目前使用的體外受精培養基和體外獲能培養基是在臺式液、Kerb-Ringer氏液和BO液基礎上添加適當的能量物質，如葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽和白蛋白等改良而來的，并用獲能誘導因子來誘導獲能和頂體反應［8］。常用的獲能誘導因子有肝素、BSA、卵泡液、A23187等。

鹿精子體外獲能的研究還處在起步階段，現已有的研究表明以TALP、BO、HIS和mKRB為基礎液均可使馬鹿精子獲能，肝素和咖啡因等能有效促進馬鹿精子獲能并完成體外受精［9］。

亞?；撬嶙鳛檎T導精子獲能的誘導因子，在其他動物如鼠、牛等已有研究報道，并已經證明亞?；撬崾蔷哂袕V泛生理活性的物質［3-5］，而且研究也證實，在獲能液中同時添加亞?；撬峥娠@著提高精子活率［10-11］。

為了探討亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的誘導作用，本試驗采用上浮法，以獲能液BO／TALP基礎液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素中，分別添加亞?；撬嶂两K濃度為0，30，50，70，100，200μmol／L濃度梯度的試驗設計，觀測了精子活力、彎尾率、精子活率，以此評價亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的影響。取得的試驗結果為后續開展馬鹿體外受精等受精生物學研究提供了數據參考。