柴胡種間序列差異及其遺傳分化

何婷婷， 柴軍紅， 郝婧瑋， 陳瑜欣

(1.牡丹江師范學院， 黑龍江 牡丹江 157000； 2.重慶市煙草公司彭水分公司， 重慶 彭水 409600)

柴胡屬(Bupleurum)，隸屬于傘形科(Umbelliferae)，多年生草本，是雙子葉植物中的大屬之一。據報道，全世界約有柴胡屬植物200余種，我國已報道的有36種、17個變種以及7個變型[1]。柴胡主要分布于北半球亞熱帶地區。在中國，多產于湖北、四川等地。柴胡又名地熏，茈胡，山菜等。

藥用價值方面的研究表明，柴胡可抗菌[2]、抗癌[3]、保肝護肝[4]、利膽[5]等。此外，舒璞等[5]通過數量分類學的方法對柴胡屬植物進行了分類方面的研究，更新了中國柴胡分類系統，其中大柴胡被單獨列為一個亞屬并且命名為大葉柴胡亞屬，而其他柴胡屬植物命名為真柴胡亞屬。Liu等研究了不同的海拔高度對臺灣柴胡生長發育的影響，結果表明，高海拔地區的柴胡葉片和根的長度較大，低海拔下植株高度、根徑大小、根的重量和皂甙含量均較高[6]。

rDNA 基因中，5.8 S和28 S基因間隔的序列稱為內轉錄間隔區(Internal Transcript Spacer, ITS)，其長度和序列變化非常大，該片段是由ITS 1、5.8 S和ITS 2三個區域組成，其中ITS 1和ITS 2在不同植株中變化較大，承受較小的選擇壓力；5.8 S區域在不同植株中的變異較小，較為保守，因此，可利用該區域鑒別不同植株間的親緣關系[7]。目前，ITS應用在較多的植物物種中，農作物[8-12]、果蔬[13-16]、花卉[17-19]中均有涉獵。但在中藥研究中應用較少。

之前對于柴胡的研究主要集中在藥用價值方面，且柴胡作為常用中藥，需求量隨之增加，導致柴胡供不應求，市場混亂，真假難辨。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究選用柴胡屬10個種及1個外類群鞘山穹，詳細信息見表1。

1.2 實驗方法

本研究所需序列全部來自于NCBI數據庫，將下載序列保存為文本文檔格式，然后利用在線對比軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)進行序列比對，分析序列的差異性，整理差異堿基的變異類型，并作出折線圖。利用clustalX 1.83軟件對序列進行對比，后轉化為meg格式，進行遺傳距離的計算和系統聚類分析。

表2 不同樣本的序列分析

樣品編號 ITS ITS1 5.8S ITS2 長度/bpGC含量/%長度/bpGC含量/%長度/bpGC含量/%長度/bpGC含量/%160458.9421464.0216353.3722758.15260458.6121463.5516353.3722757.71360658.9121461.6816353.3722960.26460658.5821462.1516353.3722958.95560058.5021460.7516353.3722360.09660556.8621260.3816352.1523056.96760458.2821360.5616353.3722859.65860658.7521462.1516353.3722959.39959957.7620959.8116352.7622759.471060558.1821461.2116353.3722858.77

表3 10個柴胡屬種的ITS遺傳距離分析

樣品編號123456789101110.00020.0070.00030.0280.0320.00040.0280.0320.0180.00050.1060.1060.0960.1020.00060.0280.0210.0540.0540.1300.00070.0980.0980.0940.1000.0560.1220.00080.0260.0300.0160.0020.1000.0520.0980.00090.1020.1020.0940.0980.0300.1220.0460.0960.000100.0320.0350.0170.0170.1020.0570.1040.0190.1010.000110.3160.3190.3140.3140.3270.3420.3220.3170.3240.3180.000

注：11為鞘山芎。下同。

2 結果與分析

2.1 柴胡樣本間的序列分析

2.1.1樣本間堿基變異性研究

10個樣品柴胡種間堿基的顛換/轉換比值存在較大差異，其中出現兩個峰值，分別對應的是紫花鴨跖柴胡和黑柴胡，說明兩者堿基發生顛換的數量遠遠高于轉換(圖1)。

2.1.2樣本間GC含量分析

10個柴胡樣品的ITS全長在599～606 bp之間，其中5.8S的區段長度一致，個別樣品的GC含量有輕微減少，其余樣品的GC含量一致，說明該區段較為保守。ITS 1和ITS 2區段的序列長度及GC含量均存在一定程度的變異，說明這兩個區段內的核苷酸較為多變，能夠提供較為豐富的變異位點(表2)。

注：1為北柴胡；2為銀州柴胡；3為紅柴胡；4為紫花鴨跖柴胡；5為竹葉柴胡；6為馬爾康柴胡；7為小柴胡；8為黑柴胡；9為有柄柴胡；10為大葉柴胡。下同。

2.2 遺傳距離分析

10個樣本間的遺傳距離在0～0.130之間(表3)，北柴胡和銀州柴胡；紅柴胡和紫花鴨跖柴胡、黑柴胡、大葉柴胡兩兩間的遺傳距離相對較小，在0.002～0.019之間，其中紫花鴨跖柴胡與黑柴胡間遺傳距離最小，僅有0.002。

圖2 10個柴胡種ITS系統發育分析

北柴胡和竹葉柴胡、小柴胡、有柄柴胡；銀州柴胡和竹葉柴胡、小柴胡、有柄柴胡；紅柴胡和紫花鴨跖柴胡、小柴胡、有柄柴胡；紫花鴨跖柴胡和竹葉柴胡、小柴胡、有柄柴胡；竹葉柴胡和馬爾康柴胡、黑柴胡、大葉柴胡種間的遺傳距離表現得相對較大，在0.094～0.130之間，其中竹葉柴胡和馬爾康柴胡種間的遺傳距離最大，達0.13。

以上結果均表明，本研究所選用的10個柴胡種間的遺傳距離存在顯著差異，各種間遺傳距離跨度較大，說明柴胡種間序列差異較大。

2.3 柴胡種間親緣關系分析

由圖2可知，本研究中所采用的10個柴胡種主要分成兩大分支：

第一大分支包含小柴胡、竹葉柴胡與有柄柴胡。其中竹葉柴胡和有柄柴胡在同一個小分支中，同源性較高，達到94%，推測竹葉柴胡和有柄柴胡可能來自同一個祖先。

第二大分支又分為2個小的分支，分支Ⅰ中的柴胡種有北柴胡、銀州柴胡和馬爾康柴胡，而北柴胡和銀州柴胡的親緣關系又較為親近，同源性達到97%；而分支Ⅱ中的紅柴胡、大葉柴胡雖然和黑柴胡與紫花鴨跖柴胡(黑柴胡與紫花鴨跖柴胡的同源性高達99%)在同一個大分支中，但是又各自單獨在一個分支內，說明紅柴胡、大葉柴胡同黑柴胡與紫花鴨跖柴胡等其他種間仍然存在一定差異。而與10個柴胡屬同科的植物鞘山芎另成一個大分支，表明鞘山芎與10個柴胡屬植物差異很大。

3 討 論

柴胡是常見中藥，目前對于柴胡的研究多集中在其活性成分及其藥用價值上，對不同柴胡種間親緣關系及在某一基因上的序列差異的相關研究較少。本研究對10個柴胡種在ITS基因位點上的序列進行親緣關系的相關研究，發現個別種的歸屬與中國植物志上的分類存在一定差異。本研究結果顯示，有柄柴胡與竹葉柴胡的序列差異性較小，同源性高達94%；而在中國植物志中，有柄柴胡與紫花鴨跖柴胡由于莖基部非木質化，葉非橢圓形而聚為一類，但二者之間也存在形態上的細微差異，例如莖生葉是否存在柄，具有幾片總苞片。此外，銀州柴胡的歸屬也存在細微差異，本研究結果顯示其與北柴胡的親緣關系較近，而中國植物志中銀州柴胡與紅柴胡的親緣關系較近，葉均為線形，根表面均為淡紅棕色。

柴胡作為常用藥，對流感、感冒等上呼吸道感染有較好療效。本屬中作為中藥原料的約有20余種，其中北柴胡、銀州柴胡、紅柴胡等具有代表性[1]。杜江對柴胡的轉錄組進行研究，結果表明，只有59.06%的Unigene獲得了不同數據庫的注釋，另外沒有注釋到的基因可能是由于其物種的相關研究信息較少，可參考的數據匱乏所致[20]。這就需要后續的深入研究，對未注釋到的基因進行深度的生物信息學分析，以期為柴胡種的分類、功能基因的開發利用提供前期數據支撐[20]。