長足大竹象染色體核型分析

汪振宇，衛紀，廖鴻，楊瑤君，龍文聰

樂山師范學院生命科學學院，竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室，樂山 614000

長足大竹象（Cyrtotrachelus buquetiGuer）屬鞘翅目象甲科，是目前竹林的最主要有害蟲類之一，對叢生的竹林的危害率達到50%～90%[1]，2003年，長足大竹象已被列為我國林業危險性有害生物的一種。該蟲主要分布在我國四川、廣東、廣西、貴州等地，國外主要分布泰國、緬甸、越南等東南亞國家[2-3]。在長足大竹象的探究方面，李濤、聶學文等研究了長足大竹象生物學特性及防治試驗[2-3]，鞠瑞亭、玉鵬等分別研究報道了該蟲的在四川地區、上海地區及廣西地區的發生、危害及防治[4-5]，楊樺等一些學者研究了長足大竹象的繁殖行為和交配行為[6]，忙定澤等人提取和鑒定了長足大竹象成蟲體表的信息化學物質[7]，蒲遠鳳等分析和評價了該蟲的營養成分[8]，楊瑤君等研究了長足大竹象的前胸背板、鞘翅、觸角的超微結構及對竹筍揮發物的觸角電位反應，研究了該蟲的生殖系統、呼吸系統的形態及超微結構，蟲口密度與蟲孔數、竹筍受害率的關系以及幼蟲種群動態對氣候的預測模型等[9-14]。尚未有長足大竹象染色體核型分析的研究報道，而染色體核型分析是遺傳學、分子生物學、分類學等研究的基礎。本研究以長足大竹象精巢為研究材料，研究了長足大竹象染色體的數目、形態等，并分析其核型特征，為期為長足大竹象的進一步研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為長足大竹象成蟲，采集自四川省樂山市沐川縣大楠鎮（經度104.00，緯度28.96），在實驗室條件下進行人工飼養。室內飼養溫度25℃、相對濕度75%、光周期12L∶12D，以新鮮竹筍進行飼養至性成熟期，每2d 更換1 次竹筍，待解剖用[10]。

1.2 染色體標本的制備

選取10 只性成熟期的長足大竹象雄蟲制作標本，參照汪淑芳的方法[11]，挑取解剖出來的精巢，在盛有生理鹽水的培養皿中除去其他組織，將取得的精巢置于EP 管中，在卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定過夜（8～12 h），挑出置于0.1 mol·L-1的醋酸洋紅染液中染色10～15 min，取出置于清潔的載破片上，加一滴制成壓片，用解剖針搗碎，蓋上蓋玻片，用鑷子透輕敲蓋玻片使材料分散如云霧狀，然后用濾紙吸去多余的醋酸洋紅，再進行壓片，使組織進一步分散開。

1.3 觀察與拍照

將制備好的染色體玻片在Olympus BX51 顯微鏡下觀察，在40 倍物鏡下選擇染色體分散良好，形態清晰的分裂相終變期或中期進行染色體數目統計，然后轉至100 倍油鏡下進行顯微照相。

1.4 染色體計數及核型分析

每個個體選取10 個以上形態清晰、分散適度、染色體數目完整的分裂相細胞進行顯微拍照并計數[15]，選擇拍攝的比較好的照片放大后測量染色體的臂長（Arm ratio），分析其相對長度（Relative length）實際長度（Physical length）、以及著絲粒指數（Centromeric index），染色體分類按照Levan、Kuo 提出的標準進行劃分[16-17]，核型對稱性分類按Stebbins 的標準進行劃分[18]，數據處理、作圖采用Excel 2003，染色體核型分析采用Adobe photoshop 7.0。性別決定機制是根據Dias 等通過性染色體的形態特征分析得出的方法[19]。根據染色體的長短進行編號。

2 結果與分析

2.1 染色體數目統計

通過顯微鏡觀察，共選擇出中期分裂相較好的細胞112 個，染色體計數統計結果見表1。結果表明，染色體數目低于等于18 條的細胞占總數的7.4%；染色體數目介于18 至22 條的細胞有21 個，占總數的10.7%；而染色體數目等于22 條的細胞73 個，占總數的65.2%；而高于22 條的細胞有18 個，所占比例為16.1%。由此可知，長足大竹象的染色體眾數為22，核型為2n=22，染色體臂數NF=22。

表1 長足大竹象中期分裂相染色體計數統計Tab.1 Metaphase chromosome count statictics of Cyrtotrachelusbuqueti Guer

2.2 核型分析

采用Adobe photoshop 7.0 軟件對長足大竹象處理并編號（見圖1B）。長足大竹象核型分析數據見表2?？梢钥闯?，長足大竹象的染色體數目為2n=22，性別決定機制為Xyp型，都有著絲粒結構，此外，在試驗中未觀察到次級縊痕及隨體的特征。其中16 條為中部著絲粒染色體（m），4 條為亞中部著絲粒染色體（sm），核型公式為：2n=22=16 m+4 sm+Xyp，X 染色體為中部著絲粒染色體，屬于中長染色體，在整個染色體組中排第4 位，其相對長度為10.22±0.62 μm，Y 染色體呈圓點狀，相對長度為3.93±0.08 μm，在整個染色體中最?。▓D1 箭頭所示）。1 號染色體相對長度最長，為17.92±0.27 μm，是一對中部著絲粒染色體。染色體中最長與最短染色體比大于4∶1，臂比大于2∶1 的染色體百分比為0.1，故長足大竹象的染色體核型為2C 型。

圖1 長足大竹象中期分裂相染色體（A）及染色體核型（B）圖譜Fig.1 Chromosome (A) and karyotype (B) of metaphase of Cyrtotrachelus buqueti Guer

表2 長足大竹象核型指數Tab.2 Karyotype index of Cyrtotrachelus buqueti Guer

2.3 四分體時期染色體

長足大竹象細胞在減數第一次分裂的四分體時期，顯微鏡明場和熒光觀察可以清晰的看到11 對同源染色體正在聯會（見圖2：A、B、C、D），同時在聯會時，同源染色體表現為明顯的“8”“0”“X”等形狀（見圖2E、F）。

圖2 長足大竹象精母細胞中期核型Fig.2 Chromosome kyrotype of spermatospore in mitotic metaphase of Cyrtotrachelus buqueti Guer

2.4 多倍體細胞

在實驗材料的篩選過程中發現一些多倍體（見圖3），特別是幼蟲的組織，其中成蟲精巢組織中也有相應數量的多倍體細胞，可能是脂肪體細胞，脂肪體細胞是昆蟲的營養物質貯存的主要器官，也是中間代謝的主要組織，與生長、變態和生殖等生理機能密切相關[20]。

圖3 長足大竹象脂肪體細胞Fig.3 Fat body cell of Cyrtotrachelus buqueti Guer

3 結論與討論

昆蟲染色體壓片制備的選擇很重要，不同種類的昆蟲其染色體壓片材料的制備方法也不盡相同。很多人在制備染色體標本時選用神經節、胚胎等組織勻漿后離心處理[21-22]，由于精巢（卵巢）相比其他組織而言，更容易勻漿，而繁殖期雌蟲體內存在大量的受精卵，使解剖卵巢存在很大難度。因此，根據前期預實驗對實驗材料的篩選，選擇成蟲的精巢作為最佳的實驗材料。

通過對長足大竹象染色體的制片、鏡檢、數據統計分析得出：長足大竹象染色體數目2n=22，其中常染色體10 對，性染色體1 對，均為中部/亞中部著絲粒染色體，NF=22；性別決定機制為Xyp 型，核型公式為：2n=22=16 m+4 sm+Xyp；最長染色體與最短染色體比大于4∶1，臂比大于2∶1 的染色體百分比為0.1，故長足大竹象的染色體核型為2C 型，未觀察到次級縊痕及隨體的特征。這一結果與Alexandra A 等人在2015年對四個地區的玉米象的核型分析是一致的[23]，但試驗中發現有少數細胞的染色體多于或少于2n=22，可能是在制片過程中少數染色體丟失或者染色體分散不好造成的，由于除此之外，在某些細胞中發現一些非正倍體，（1～2 個較小的染色體）(見圖1)，推斷這可能是B 染色體，B 染色體的存在會對A 染色體的形態和行為產生影響，對特定基因的表達具備積極意義，同時B 染色體數量會影響生物個體的生長、發育等。Silva 等研究了不同地區玉米象的核型分析，并發現不同地區的玉米象中B 染色體的數目不同[23]。B 染色體數目的差異在一定程度上會影響種群密度的變化，在不同的地區，B 染色體的數量不定。這一觀點Moraes 研究一致[24]。但不同物種的染色體的組成，著絲粒的位置以及染色體的形態結構存在一定差別。由于本試驗的實驗材料沒有相應的比對庫，所以不能對其進行熒光顯帶技術處理。

本研究發現長足大竹象具有大量的多倍體細胞，這一現象與七星瓢蟲成蟲脂肪體細胞核具有多倍性一致[25]，同時也與白蟻脂肪體核有多倍體相應證[26]。脂肪體能儲存蛋白質、糖類和脂肪等養分，供形成成蟲出土之前的休眠中、蛹期和成蟲期的需求，因此，幼蟲以及蛹含有豐富的脂肪體與長足大竹象的生活史中11 個月生活在地下有大的關系。

長足大竹象的細胞在減數第一次分裂的四分體期間，同源染色體間的聯會，其形態表現為“0”、“8”、“X”等形狀。這一結論與甜菜夜蛾細胞分裂期染色體的形態結構以及蝗蟲減數分裂時期的染色體形態結構是一致的[27-28]。同源染色體形成環狀、端部交叉、尾尾對的構型（見圖2E、F）。染色體交叉頻率越高，說明在減數分裂過程中，姐妹染色體及姐妹染色單體的互換頻率越高，染色體行為越復雜，越活躍，反之染色體越穩定[28]。這一細胞生物學現象對研究生物的遺傳多樣性以及進化具有十分重要的作用。