鐵皮石斛指紋圖譜及生物活性成分研究進展

郭磊　肖坤敏　徐陽　譚大聰　王軍民　華燕

摘要：鐵皮石斛（Dendrobium officinal Kimura et Migo）兼具藥用價值，不僅含有人體必需氨基酸，還含有多糖、黃酮類、生物堿等活性成分，具有降血壓、降血糖、抗腫瘤等功效。但石斛屬植物來源眾多、成分差異較大，給鐵皮石斛的鑒別帶來困難，利用指紋圖譜技術標記特征物質可以對其鑒別及品質評價提供一定的理論依據。另外，國內外學者已從鐵皮石斛中分離鑒定出多糖、黃酮類、生物堿等多種生物活性成分，證實了這些成分的藥效并推斷其生理作用機制。從多角度總結了近幾年鐵皮石斛指紋圖譜、生物活性成分及作用機制的研究進展情況，以期為鐵皮石斛的鑒定及藥物開發研究提供一定的科學依據。

關鍵詞：鐵皮石斛;指紋圖譜;活性成分;功能;作用機制

中圖分類號：Q-1;Q945 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）05-0005-05

Abstract： Dendrobium officinal Kimura et Migo has both high edible and medicinal value， which not only contains essential amino acids for human body， but also contains polysaccharides， flavonoids， alkaloids and other bioactive components， these ingredients can reduce blood pressure， blood sugar， anti-tumor and so on. However， it is difficult to identify Dendrobium officinal Kimura et Migo，because of its geographical origin and complex chemical components， use fingerprint technology could provide some theoretical basis to identify and evaluate Dendrobium officinal Kimura et Migo. In addition， domestic and foreign scholars had been isolated and identified polysaccharides， flavonoids， alkaloids and other bioactive components， the effect of these bioactive components was confirmed and their physiological mechanism was deduced. The relevant research on bioactive components and its function mechanism of Dendrobium officinal Kimura et Migo in recent years were summarized，in order to provide some scientific basis for identifying and drug developing of Dendrobium officinal Kimura et Migo.

Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo; fingerprint; bioactive components; function; function mechanism

鐵皮石斛（Dendrobium officinal Kimura et Migo）系蘭科石斛屬多年生草本植物，因表皮呈鐵綠色而得名，屬國家二級保護植物[1，2]。鐵皮石斛居“中華九大仙草”之首，富含多糖、生物堿及倍半萜類化合物等有效成分，具有抗腫瘤、增強免疫力、降低血糖等作用[3-6]。自20世紀70年代，關于鐵皮石斛莖、葉營養成分分析和藥理藥效研究就有了報道[7，8]，廖鮮艷等[9]分析發現秋季鐵皮石斛莖中水分（863.10 mg/g）、多糖（289.90 mg/g）、鐵（71.10 mg/kg）和硒（1.07 mg/kg）含量較春季高;葉中多糖（162.30 mg/g）含量比莖低，但有較高的可溶性蛋白質（4.20 mg/g）、總蛋白質（67.03 mg/g）、粗纖維（204.60 mg/g）和脂肪（14.70 mg/g）、天冬氨酸（13.60 mg/g）和谷氨酸（13.80 mg/g）等。紀照紅等[10]對新疆產的不同種植年限鐵皮石斛的營養成分分析后發現，鐵皮石斛粗蛋白質、生物堿含量在1.92%～3.81%和0.022 5%～0.029 7%，且隨著生理年齡的增加而顯著增加。1年、2年、3年生鐵皮石斛中總氨基酸含量分別為27.51、31.71、36.83 mg/g;必需氨基酸和非必需氨基酸的比值均在60%以上。張本厚等[11]比較3種鐵皮石斛組培體和人工栽培鐵皮石斛的營養成分，發現原球莖的多糖和總生物堿含量低于人工栽培鐵皮石斛，但其多糖、總生物堿和總蛋白含量均高于2種組培苗。

鐵皮石斛營養物質豐富，藥用價值很高，但產地、生長環境和栽培管理模式等因素會造成化學成分和藥用價值的差異，其偽品的鑒定也非常困難，指紋圖譜技術在鐵皮石斛的鑒定及藥物質量評價中的應用越來越廣泛。構建特征物質指紋圖譜已經是鑒別及評價鐵皮石斛品質的重要依據，而生物活性成分如多糖、黃酮類及生物堿類的結構及功能研究也為其新藥開發提供了重要的理論支撐和科學依據。

1 ?鐵皮石斛指紋圖譜

指紋圖譜是一種綜合、宏觀、可量化的鑒別手段，已公認為天然藥物質量及產地鑒別的最有效手段[12]，在鐵皮石斛鑒別及食品、保健品加工領域有著廣泛的應用。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜是鐵皮石斛品質鑒定的常用方法，紫外（UV）指紋圖譜可以分析不同物質體系的化學成分和不飽和程度的差異，在中藥材產地鑒別方面有較好的應用。

李俊等[13]在浙江、云南和福建建立了13批鐵皮石斛樣品的HPLC指紋圖譜，分析得出結論：鐵皮石斛內在質量受品種、栽培基質的影響較大，受產地的影響較小。謝魯靈楓等[14]構建了霍山鐵皮石斛及其他產地鐵皮石斛甲醇提取物HPLC指紋圖譜，發現不同產地鐵皮石斛的總黃酮、柚皮素、石斛酚含量較高，多糖含量較低，通過共有指紋圖譜模式發現5批鐵皮石斛的相似度很高，在92.6%～94.8%。李杰等[15]分析了29份云南、浙江、湖南、廣西和廣東不同產地鐵皮石斛醇溶性浸出物的HPLC指紋圖譜，分析出13個共有峰，除1份云南樣品與對照圖譜的相似度為67.6%外，其余樣品的相似度均在75.1%～93.4%，多糖、醇溶性浸出物含量與相似度間并沒有明顯的相關性。王少平等[16]利用HPLC指紋圖譜分析鐵皮石斛及偽品中柚皮素含量，發現正品鐵皮石斛指紋圖譜之間有較大相似性，與偽品有較大差異性，且柚皮素含量有一定差異。鄧星燕等[17]以石油醚、氯仿和無水乙醇為溶劑提取鐵皮石斛樣品并進行紫外光譜測定，建立了快速鑒別不同產地鐵皮石斛的方法，可以準確區分不同產地的鐵皮石斛樣品。

相關序列擴增多態性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于PCR的標記系統，其重復性、多態性及共顯性等較高，廣泛應用在種質資源鑒定、遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建等方面[18]。李懷志等[19]使用25對SRAP引物對鐵皮石斛進行遺傳多樣性分析，構建了20份石斛品系的SRAP特征指紋圖譜，揭示了鐵皮石斛不同品系之間關系的遠近，能夠為品種鑒定提供準確的信息。

2 ?鐵皮石斛的生物活性物質

化學成分是鐵皮石斛發揮活性的物質基礎，鐵皮石斛的生物活性成分研究始于20世紀80年代，目前發現的生物活性物質主要有多糖、生物堿、黃酮類、芪類等[20，21]。

2.1 ?多糖

多糖類是鐵皮石斛重要的生物活性物質，但不同部位、產地、采收時機及貯存條件等因素對鐵皮石斛多糖含量的影響不同，闕彩霞等[22]研究得出華南地區溫室產鐵皮石斛苗葉片多糖存在于細胞壁和液泡中，莖段多糖存在于細胞質中，苗栽第2年4月的多糖含量達峰值40.85%。徐德林等[23]分析出浙江樂清產鐵皮石斛的多糖含量高出云南品系的2～3倍，相同生境下浙江樂清兩個品系的多糖含量也有157.21 mg/g的差異，說明地理環境和基因型會導致多糖含量有明顯差異。王琦等[24]研究獲得了鐵皮石斛多糖的積累規律，結果顯示多糖及其關鍵組分甘露糖的含量與培養月齡呈正相關，但各培養月齡多糖含量均在5-6月達到峰值，說明采收季節會顯著影響多糖及其組分的含量。Yu等[25]研究了鐵皮石斛采后在常溫（25 ℃）、低溫（4、0 ℃）下貯藏90 d內多糖含量的變化，發現多糖含量呈先增加后減少的趨勢，采用低溫儲藏后多糖含量整體有所增加，且體外抗氧化活性明顯高于常溫貯藏。

多糖的化學結構包括單糖殘基組成與排列順序、相鄰糖殘基連接方式及糖鏈分支等，周桂芬等[26]對14個不同種植基地產鐵皮石斛的莖葉多糖含量與單糖組成進行了比較，得出葉中多糖含量約為相應莖中的1/3，莖中多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成，葉多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，莖和葉中的多糖中均以甘露糖比例最高。Pan等[27]通過GC-MS分析出鐵皮石斛多糖中的單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖（摩爾比為0.04∶0.12∶1.00∶0.13）。高云霄等[28]從珠海產鮮鐵皮石斛中分離出單一多糖（SDOP），檢測其重均分子量為1.66×106，由甘露糖和葡萄糖（摩爾比4.9∶1.0）組成，并推測出SDOP是以1，4-鏈接為主，存在少量1，2，4-，1，3，4-，1，4，6-分支結構和端基結構的O-乙?；细事毒厶?。雷思敏等[29]從龍石山鐵皮石斛分離純化出中性多糖（DOP-1），分析其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖（摩爾比為3.80∶0.25∶1.50∶3.80∶2.10∶1.30）組成。Zeng等[30]從鐵皮石斛內生真菌鐮刀菌中提取出一種新多糖（DG2），檢測出分子質量為152.8 kDa，是由半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖（摩爾比4.3∶1.9∶2.8∶1.0）組成，主要鏈接類型有（1→）-β-D-葡萄糖、（1→4）-β-D-葡萄糖、（1→3、6）-β-D-半乳糖和（1→6）-β-D-半乳糖。

現代藥理和臨床研究證明，鐵皮石斛多糖具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖和提高免疫力等作用，在惡性腫瘤的輔助治療以及慢性咽炎、慢性胃炎、糖尿病和久病體虛免疫功能等方面有著廣泛的應用，已成為當前研究的熱點[31，32]。李杰等[33]用不同純度鐵皮石斛多糖對昆明小鼠灌胃，發現多糖純度高會使小鼠免疫器官指數、遲發性變態反應、抗體積數和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力等免疫學指標增大，也能顯著增強小鼠的碳粒廓清指數、緩解環磷酰胺對小鼠的免疫抑制作用，對脾虛便秘小鼠的腸道微生態平衡和腸道酶活性方面有一定的促進作用[29，34-36]。勞梓釗等[37]發現0.9%鐵皮石斛多糖可明顯提高果蠅的抗氧化能力，0.3%、0.9%的多糖能提高果蠅SOD、CAT水平，降低MDA含量。歐陽一鳴等[38]研究多糖高劑量組（1.34 g/kg）、中劑量組（0.67 g/kg）、低劑量組（0.335 g/kg）對亞硝基胍（MNNG）誘發的大鼠慢性萎縮性胃炎（CAG）的作用，證實鐵皮石斛多糖對CAG大鼠有良好的保護作用，可有效恢復體重并緩解胃黏膜萎縮。何小群等[39]通過腹腔注射戊四氮（PTZ）來建立癲癇大鼠模型，證明了鐵皮石斛多糖對PZT誘導后癲癇大鼠腦神經元有保護作用，推測其作用機制是抑制核轉錄因子（NF-kB）信號通路的激活，從而減輕癲癇的發作程度。童微等[40]通過體外試驗研究發現硫酸化和脫乙?；揎椇蟮蔫F皮石斛多糖能夠增強RAW264.7巨噬細胞的免疫活性，而羧甲基化修飾表現出了顯著的抑制作用。黃杰等[41]研究得出鐵皮石斛多糖（DOP）能降低巨噬細胞TNF-α、IL-6、NO的釋放水平，并推測DOP可能與促進細胞吞噬活性、降低炎癥因子釋放水平和改變細胞極化分型有關。鐘惠娟等[42]研究得出多糖濃度（44 mmol/L）能顯著抑制大鼠胸主動脈內皮依賴性舒張功能（EDR），增加胸主動脈中葡萄糖調節蛋白78（GRP78）和C/EBP同源蛋白（CHOP）及核轉錄因子-KB（NF-KB）的表達。吳耽等[43]研究得出多糖在濃度（50～300 μg/L）內能起到抗阿司匹林損傷的作用。李靜文等[44]分析得出鐵皮石斛多糖（PDC）可以降低糖尿病視網膜病變大鼠體內炎癥因子（IL-6、TNF-α）的表達，進而抑制血管內皮生長因子（VEGF）表達上調。Fu等[45]通過體外發酵研究了鐵皮石斛多糖對人腸道菌群組成和代謝的影響，結果表明多糖可以改善胃腸道健康。

2.2 ?黃酮類

黃酮類化合物也是鐵皮石斛的主要生物活性成分，不同地理來源鐵皮石斛的黃酮類化合物成分有很大的差異。梁芷韻等[46]采用HPLC分析了廣東、廣西、云南等地27批鐵皮石斛的黃酮類成分，共標示出13個特征峰，鑒別出6個黃酮碳苷（新西蘭牡荊苷Ⅱ、新西蘭牡荊苷Ⅰ、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、佛萊心苷和異佛萊心苷）和1個黃酮氧苷（蘆?。?個特征峰。呂朝耕等[47]利用超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定了鐵皮石斛的黃酮類成分，結果表明不同產地鐵皮石斛中黃酮類成分在組成和含量上存在較大差異，各成分中柚皮素含量最高（26.87 μg/g），其次為圣草酚（1.20 μg/g）與異鼠李素（0.91 μg/g），其余成分都在0.5 μg/g以下。黎晶晶等[48]采用HPLC法鑒定出6種鐵皮石斛黃酮類成分，分別是芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、異夏佛托苷、夏佛托苷、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷和柚皮素，可用于鐵皮石斛的成分分析及質量評價。黃月純等[49]比較了丹霞地貌種源、浙江本地種、鐵皮蘭種鐵皮石斛葉黃酮類成分HPLC 特征圖譜的差異，得出相同種源葉黃酮類成分基本一致，不同種源成分群組成及比例存在明顯差異。

鐵皮石斛葉總黃酮類化合物具有較強的抗氧化活性，羅穎懿等[50]發現不同種源的共性黃酮類成分新西蘭牡荊苷Ⅱ（芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷）在體外有一定的抗氧化作用，能有效抑制HepG2細胞增殖，并可能通過調控MAPK通路及Bax/Bcl-2途徑誘導HepG2細胞凋亡。高海立等[51]研究鐵皮石斛葉總黃酮（TFDL）經D101型樹脂純化后的抗氧化活性，結果顯示TFDL在DPPH、ABTS+及Fe2+ 3種體系中的抗氧化活性具有濃度依賴性，IC50分別為0.112 3、0.784 5和0.643 4 mg/mL，并且TFDL對DPPH的清除能力最強。周桂芬等[52]對鐵皮石斛不同部位種黃酮碳苷類成分及抗氧化作用進行比較，得出葉和花中的黃酮二糖碳苷類含量明顯高于莖，根中含量較少，葉中黃酮類成分對DPPH自由基的清除能力優于莖。

2.3 ?生物堿

生物堿是石斛藥材中最重要的活性成分之一，1964年犬伏康夫等發現石斛生物堿為倍半萜骨架結構，也是最早分離并進行結構確認的化合物[53，54]。汪群紅等[55]用堿性氯仿提取不同來源的鐵皮石斛生物堿，發現組培品的總生物堿含量最高（0.091%），野生品（0.085%）次之，人工栽培品（0.043%）最低。唐麗等[56]研究不同生長時間鐵皮石斛莖與葉中總生物堿的含量差異，結果表明總生物堿主要集中于葉，1年齡葉中含量最高（0.036%），3年齡以內的總生物堿含量相對較高，但植株生長至4、5年齡時，總生物堿含量明顯較低。王自布等[57]研究了鐵皮石斛快繁優化及不同時期生物堿含量的積累，結果表明生根壯苗的最佳組合為IBA 1.5 mg/L、香蕉泥100 g/L和活性炭0.1%，生根率達到100%;愈傷組織形成后30 d左右時總生物堿含量（0.36%）最高。王洪秋等[58]研究了不同pH培養液對鐵皮石斛原球莖生物堿含量的影響，結果表明培養液pH為5.8時生物堿生產量（3.15 mg/L）達到最高，殼聚糖（15 mg/L）和普魯蘭多糖（100 mg/L）混合處理可明顯提高生物堿的積累量，達到了5.07 mg/L。

陳存武等[59]采用HPLC-UV-CL聯用測定鐵皮石斛生物堿組分清除自由基能力，結果表明霍山鐵皮石斛的4種生物堿可降低魯米諾-雙氧水發光體系的發光值，peak10生物堿活性最強，校正清除率達5.2%，而含量較高的peak11校正清除率僅為2.6%。王杰等[60]將鮮鐵皮石斛生物堿提取物分為高、中、低劑量（20、10、5 g/kg）組，研究得出鮮鐵皮石斛生物堿提取物對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤有明顯的抑制作用，推測其機制可能與提高脾臟指數、調節血清中TNF-α和IL-2水平有關。

2.4 ?其他

目前，有很多學者對鐵皮石斛進行不同溶劑萃取來研究提取物的體外抗氧化活性，高維等[61]比較2年生和4年生鐵皮石斛水提物對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，發現4年生鐵皮石斛提取物對兩種自由基的清除能力高于2年生的水提物。謝慶芬等[62]研究霍山鐵皮石斛提取物不同極性部位的體外抗氧化活性，分析得出霍山鐵皮石斛提取物正丁醇部位在DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及總抗氧化能力上都比較強。

很多動物試驗也證明了鐵皮石斛提取物在降壓、防胃癌、保護皮膚、預防潰瘍性結腸炎、修復肌肉損傷等方面的作用。鐵皮石斛水提物與醇提物對自發性高血壓（Spontaneous hypertension rat，SHR）大鼠有明顯的降壓作用，兩種提取物都能顯著降低SHR大鼠的血壓，醇水提取物降壓效果優于相同劑量的水提物，優于苯磺酸氨氯地平，醇水兩提物及水提物對血漿AngⅡ激素含量沒有影響[63，64]。姚堯等[65]研究得出鐵皮石斛水提物可有效改善糖尿病小鼠體內腸道菌群，提高其免疫力，并使小鼠體內脂質代謝恢復平衡，減少動脈粥樣硬化的發生概率。趙佩等[66]研究了鐵皮石斛甲醇提取物對小鼠潰瘍性結腸炎（Ulcerativecolitis，UC）的治療作用及機制，發現醇提物對UC小鼠有治療作用，并推測可能是通過抑制IFN-γ、TNF-α釋放，阻斷炎癥的放大效應而達到治療效果。田林娜等[67]研究鐵皮石斛水提物對運動性損傷的修復作用，結果表明水提物能正向調控C2C12細胞和骨骼肌組織的EGFR表達水平，起到促進骨骼肌細胞增殖的作用，對骨骼肌運動性損傷起到一定的修復作用。趙益等[68，69]研究了鐵皮石斛提取物（DOE）通過調節內源性代謝產物及相關基因預防胃癌前病變的作用機制，結果表明DOE能夠降低鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosine-1-phosphate，S1P）的表達，從而預防胃癌的發生。盧秋靜等[70]研究鐵皮石斛水提物（DOE）抗小鼠皮膚光損傷的保護作用，結果表明水提物可減少小鼠皮膚組織內的各種活性氧自由基（ROS），提高小鼠皮膚組織內的基質金屬蛋白酶抑制因子，從而保護紫外光線引起的皮膚光損傷。

3 ?結論

鐵皮石斛是中國的傳統藥用植物，化學成分包含多糖、黃酮類、生物堿、芪類、蛋白質、氨基酸、礦質元素、揮發油等，多糖、黃酮類及生物堿等成分不僅是通過色譜指紋圖譜判別鐵皮石斛的重要依據，也是鐵皮石斛主要的生物活性成分，國內外許多學者對這些活性成分在鐵皮石斛不同生長期不同采收期含量的變化、結構分析及藥理作用做了大量的研究。筆者從不同角度總結了近幾年國內外關于鐵皮石斛指紋圖譜及生物活性成分的研究，以期為鐵皮石斛的鑒別、品質評價和藥物開發提供一定的理論依據和科學參考。

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