貝伐單抗結合紫杉醇對肺癌小鼠的治療效果及對癌組織S100A4和MMP-9的影響

毛衛波，朱憶凌，嚴禮平，周佳慧，黃淵，陳國榮

（1.溫州醫科大學附屬第五醫院 麗水市中心醫院 病理科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015）

大部分肺癌患者在診斷時已屬于中晚期，1年生存率極低，且發病率逐年上升[1]。目前臨床上治療肺癌的方式主要為化療、放療和手術治療，但化療放療的不良反應較為嚴重，手術治療也只適用于肺癌早期患者，因此篩選出不良反應小，抗癌效應強的藥物是當前研究的重點。紫杉醇可從短葉紫衫樹皮中提取，對Leweis肺癌細胞的生長有顯著的抑制作用[2]。有研究表明，紫杉醇抗血管生成能力較強，能顯著抑制腫瘤細胞血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，進而間接抑制腫瘤細胞血管的形成[3]。但紫杉醇本身具有一定的細胞毒性，因此，尋找能提高紫杉醇療效的抗腫瘤藥物是當前治療肺癌的重要方向。貝伐單抗作為一種重組的人源化單克隆抗體，也能與VEGF結合并阻斷其生物活性，從而有效地抑制腫瘤血管生成[4-5]，本研究擬分析兩者結合應用的抗腫瘤效果是否能優于單味藥。S100鈣結合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9蛋白都參與了腫瘤細胞遠處侵襲轉移的過程，它們表達水平的變化對于監測腫瘤的發展具有指導意義。本研究通過對腫瘤細胞VEGF和相關蛋白表達的變化來闡述貝伐單抗結合紫杉醇的抗癌效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：鼠源性Leweis肺癌瘤株，由國家實驗細胞資源共享平臺提供。

1.1.2 實驗動物：50只SPF級健康C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量20～25 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證：SCXK（浙）2016-0010。

1.1.3 藥品與主要試劑：紫杉醇，規格：30 mg/支，國藥準字H20053837（合肥大東方藥業有限責任公司）；貝伐單抗，規格：100 mg/支，批號：B6003B02（上海羅氏制藥有限公司）；IL-2、IL-6、TNF-α和VEGF的ELISA試劑盒，均購自南京建成生物有限公司；S100A4和MMP-9的ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；S100A4和MMP-9試劑盒購于上海森雄科技實業有限公司。

1.1.4 主要儀器：7600全自動生化分析儀（日本日立公司）、3K15超低溫離心機（德國Sigma公司）、酶標儀（美國博騰儀器公司）、 CytoFLEX流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模：將Leweis肺癌細胞在37 ℃下快速解凍，復蘇后的細胞采用含10%胎牛血清的培養基培養，培養至正常狀態下，取對數生長期的癌細胞接種于小鼠右腋下，21 d后，對狀態較好的小鼠脫頸椎處死，取出生長完整的瘤組織，將其包膜剔除，制成癌細胞懸液后，分別取0.2 mL接種于小鼠右腋下（細胞數目：2×106/只）。

1.2.2 實驗分組與給藥方法：將實驗小鼠分為正常組（未接種瘤液）、模型組（接種瘤液）、貝伐單抗組（接種瘤液）、紫杉醇組（接種瘤液）、聯合組（接種瘤液），每組8只。正常組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.4 mL/只，每周2次；貝伐單抗組腹腔注射15 mg/kg貝伐單抗，每周2次；紫杉醇組腹腔注射10 mg/kg紫杉醇，每周2次；聯合組分別腹腔注射15 mg/kg貝伐單抗和10 mg/kg紫杉醇，每周2次。所有小鼠給藥2周。

1.2.3 瘤重與抑瘤率：給藥2周后，處死小鼠，取出腫瘤組織稱重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重× 100%。

1.2.4 ELISA法測定IL-2、IL-6及TNF-α的含量：給藥2周后，小鼠摘眼球取血2～3 mL，靜置2～3 h后，以3 000 r/min離心10 min，取血清。ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IL-6及TNF-α的含量。

1.2.5 采用流式細胞技術檢測T淋巴細胞亞群：同上得血清，采用流式細胞儀檢測血清中CD3+、CD4+、CD8+的比例，并計算CD4/CD8比值。

1.2.6 ELISA法和Western blot法測定VEGF含量及蛋白表達水平：同上得血清，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中VEGF含量。取出的腫瘤組織，定量稱取做組織勻漿，用Western blot法檢測其中VEGF表達水平。

1.2.7 ELISA法測定腫瘤組織中S100A4與MMP-9表達水平：同上的組織勻漿，按照ELISA試劑盒說明書操作檢測組織中S100A4與MMP-9含量。

1.3 統計學處理方法 采用軟件SPSS20.0進行統計學分析。計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 貝伐單抗結合紫杉醇對肺癌小鼠瘤重以及抑瘤率的影響 連續給藥2周后，貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯合組的瘤重顯著低于模型組（P＜0.05），且紫杉醇組、聯合組的瘤重顯著低于貝伐單抗組（P＜0.05）；聯合組抑瘤率明顯高于貝伐單抗組和紫杉醇組（P＜0.05），紫杉醇組抑瘤率明顯高于貝伐單抗組（P＜0.05）。見表1。

表1 5組小鼠瘤重、抑瘤率的比較（每組n=8， ）

表1 5組小鼠瘤重、抑瘤率的比較（每組n=8， ）

與模型組比：aP＜0.05；與貝伐單抗組比：bP＜0.05；與紫杉醇組比：cP＜0.05

組別 瘤重（g） 抑瘤率（%）正常組 - -模型組 7.48±0.66 -貝伐單抗組 4.12±0.86a47.25±4.54紫杉醇組 3.13±0.34ab73.02±6.98b聯合組 0.99±0.28abc88.12±9.08bcF12.343 243.432P＜0.001 ＜0.001

2.2 貝伐單抗結合紫杉醇對肺癌小鼠血清中IL-2、IL-6及TNF-α含量的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯合組小鼠血清中的IL-2、IL-6及TNF-α含量與正常組比較升高（P＜0.05）；貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯合組的上述指標含量顯著低于模型組（P＜0.05）；同時紫杉醇組以及聯合組的上述指標含量明顯低于貝伐單抗組（P＜0.05）；紫杉醇組血清IL-2和IL-6含量明顯高于聯合組（P＜0.05），而紫杉醇組血清TNF-α含量明顯低于聯合組（P＜0.05），見表2。

表2 5組小鼠IL-2、IL-6及TNF-α含量的比較（每組n=8， ，pg/mL）

表2 5組小鼠IL-2、IL-6及TNF-α含量的比較（每組n=8， ，pg/mL）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 IL-2 IL-6 TNF-α正常組 110.43±11.21 33.02±4.89 98.02± 4.89模型組 265.48±14.66a75.06±6.88a300.06±26.88a貝伐單抗組 206.12±12.86ab51.25±5.54ab262.25±20.54ab紫杉醇組 198.13±12.34abc45.02±3.98abc117.02±20.98abc聯合組 120.99±13.28abcd37.12±4.08abcd152.12±26.08abcdF132.234 104.561 201.232P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 貝伐單抗結合紫杉醇對肺癌小鼠T淋巴細胞亞群的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯合組小鼠血清中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8的水平與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯合組的上述指標含量與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；紫杉醇組及聯合組的上述指標含量與貝伐單抗組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；紫杉醇組與聯合組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 貝伐單抗結合紫杉醇對肺癌小鼠VEGF含量及蛋白表達水平的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯合組小鼠血清VEGF含量以及癌組織VEGF蛋白表達水平與正常組比升高（P＜0.05）；給藥2周后，貝伐單抗組、紫杉醇組以及聯合組的上述指標與模型組降低（P＜0.05）；紫杉醇組及聯合組的上述指標與貝伐單抗組比差異有統計學意義（P＜0.05）；紫杉醇組與聯合組比差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表3 5組小鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8水平的比較（每組n=8， ）

表3 5組小鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8水平的比較（每組n=8， ）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4/CD8正常組 66.43±6.21 42.02±4.89 23.02±3.89 1.72±0.29模型組 38.48±4.66a25.06±3.88a32.06±3.88a0.86±0.18a貝伐單抗組 50.12±3.86ab34.25±4.54ab25.25±3.54ab1.25±0.34ab紫杉醇組 21.13±3.34abc20.02±3.98abc38.02±3.98abc0.52±0.18abc聯合組 43.99±3.28abcd30.12±3.08abcd28.12±4.08abcd1.02±0.08abcdF33.234 45.432 234.453 23.222P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 5組小鼠VEGF含量和蛋白相對表達水平比較（每組n=8，）

表4 5組小鼠VEGF含量和蛋白相對表達水平比較（每組n=8，）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 含量（pg/mL） 蛋白相對表達水平正常組 10.43±1.21 0.35±0.11模型組 33.48±4.66a0.97±0.16a貝伐單抗組 23.12±2.86ab0.60±0.16ab紫杉醇組 28.13±3.34abc0.71±0.14abc聯合組 20.99±2.28abcd0.44±0.11abcdF342.123 123.342P＜0.001 ＜0.001

2.5 貝伐單抗結合紫杉醇對肺癌小鼠S100A4與MMP-9含量的影響 模型組、貝伐單抗組、紫杉醇組、聯合組小鼠癌組織中S100A4與MMP-9含量顯著高 于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，貝伐單抗組、紫杉醇組、聯合組小鼠癌組織中S100A4、MMP-9的含量顯著降低（P＜0.05）；紫杉醇組及聯合組S100A4、 MMP-9含量較貝伐單抗組降低（P＜0.05）；與紫杉醇組比較，聯合組小鼠癌組織中S100A4與MMP-9含量顯著減少（P＜0.05）。見表5。

表5 5組小鼠S100A4、與MMP-9含量比較（每組n=8， ，pg/mL）

表5 5組小鼠S100A4、與MMP-9含量比較（每組n=8， ，pg/mL）

與正常組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05；與貝伐單抗組比：cP＜0.05；與紫杉醇組比：dP＜0.05

組別 S100A4 MMP-9正常組 926.02±105.78 17.02±1.89模型組 2 836.06±199.34a47.06±6.88a貝伐單抗組 2 288.25±421.83ab40.25±8.54ab紫杉醇組 1 933.02± 3.98abc37.02±4.98abc聯合組 1 508.12±116.90abcd32.12±6.08abcdF336.339 112.398P＜0.001 ＜0.001

3 討論

抗腫瘤藥物的聯合使用是當前最主要的腫瘤治療方式?；熓悄壳芭R床治療肺癌的主要治療手段，充分了解化療藥物的藥理機制對臨床合理應用具有重要參考價值。目前貝伐單抗聯合紫杉醇是臨床上治療非鱗非小細胞肺癌的常用方案。本研究結果顯示，貝伐單抗聯合紫杉醇能顯著降低小鼠的瘤重，提高抑瘤率。貝伐單抗能特異性地結合VEGF，影響腫瘤血管的形成，從而抑制癌細胞的生長，同時紫杉醇的作用靶點在微管蛋白，其能抑制微管的有絲分裂從而使癌細胞凋亡壞死。兩者在抗腫瘤的形成與發展中起協同作用。

IL-2和IL-6是在炎癥反應中起重要的細胞因子，其能促進T細胞的增殖，誘導多種殺傷細胞的分化，還能誘導TNF-α、IFN-λ等炎癥反應因子的產生，從而誘導腫瘤細胞的增殖，研究證明貝伐單抗能顯著降低腫瘤小鼠體內炎性因子的水平，改善小鼠免疫能力[6-7]。而過量的TNF-α與受體結合后能激活細胞核因子以及調控細胞間信息的激酶，促進腫瘤細胞的轉移與侵襲。有研究證明，抑制TNF-α表達，能夠改善機體的代謝，抑制腫瘤的復發與轉移[8]。本研究也驗證了貝伐單抗結合紫杉醇能顯著降低肺癌小鼠TNF-α、IL-2和IL-6水平，同時改善小鼠細胞免疫能力（CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8）。進一步說明兩種藥物的聯合使用能更有效地抑制腫瘤細胞的增殖擴散，減輕小鼠體內腫瘤的負荷，一定程度上提高了細胞因子的分泌水平，促進了免疫功能的恢復。同時腫瘤的形成及生長需要新生血管來為其提供生存所需的氧氣和營養物質[9-11]。VEGF能夠增加血管滲透性導致蛋白沉積，從而促進了血管的生成。有研究報道腫瘤血管的抑制會造成腫瘤細胞的凋亡壞死，并證明紫杉醇的抗腫瘤作用與其能抑制血管生成有關[12]。貝伐單抗作為一種重組的人源化單克隆抗體，也能與VEGF結合并阻斷其生物活性，從而使腫瘤血管形成受到阻礙，導致腫瘤組織萎縮。本研究結果表明，貝伐單抗組和紫杉醇組均能顯著降低肺癌小鼠血清中VEGF的含量，但聯合組的效果最好。其原因分析主要是貝伐單抗作為血管生成抑制劑，能夠誘導腫瘤血管的結構、功能發生改變，使其失去腫瘤血管的病理特征，并趨向于正?；?，從而改善了腫瘤微環境，同時聯合紫杉醇，能夠增加滲透到腫瘤內的藥物量，提高化療的效果。

MMP-9是鋅金屬蛋白酶超家族重要的一員，屬于明膠酶，能夠降解細胞外基質。研究證明[13]，MMP-9通過分解正常細胞外基質和基底膜，使癌細胞能夠進入血液，參與循環，進一步導致腫瘤細胞轉移。MMP-9也參與腫瘤血管形成，增強腫瘤細胞遠處侵襲轉移的能力[14]。S100A4是重要的功能蛋白，它主要介導了細胞信號傳導、細胞外基質分泌和細胞的增殖分化。有研究表明S100A4參與腫瘤細胞遠處侵襲轉移過程[15-16]。本研究結果顯示，模型組小鼠癌組織中的S100A4與MMP-9的含量明顯高于貝伐單抗組和紫杉醇組，同時還發現相比于紫杉醇組和貝伐單抗組，聯合組更能顯著降低C57BL/6小鼠肺癌組織中S100A4與MMP-9含量。由于在抗腫瘤治療過程中，單一的給藥治療容易出現耐藥現象，而貝伐單抗與紫杉醇具有協同效應，能進一步增加了抗腫瘤的效果。巨噬細胞釋放大量的MMP-9蛋白，以及S100A4蛋白的過量表達能夠增強腫瘤細胞的侵襲，而貝伐單抗結合紫杉醇能增強紫杉醇對癌細胞的殺傷力，提高機體的免疫能力，從而降低MMP-9以及S100A4蛋白的表達。

綜上所述，貝伐單抗結合紫杉醇治療能夠增強抗腫瘤的效果，降低腫瘤小鼠血清中VEGF的含量以及肺癌組織中S100A4與MMP-9含量，但其對抗腫瘤細胞的分子機制的作用、抗癌基因的作用還需要進一步闡明。