寧夏布魯氏菌多位點串聯重復序列分型研究

馬學平，高建煒，韓 坤，楊 聰，海 娥，樸東日，姜 海，崔步云，趙建華

布魯氏菌屬(Brucella)細菌是引起布魯氏菌病(Brucellosis)的病原體[1]，目前分為6個種19個生物型[2]，羊種、豬種和牛種是感染人體的主要種型[3]，羊種是我國主要的感染人體種型[4]。布魯氏菌由于具有廣泛的宿主和遺傳多樣性，其種間核苷酸序列一致性在99%以上[5]，傳統方法分型煩瑣，具有生物安全風險。多位點串聯重復序列分析(MLVA)技術具有簡單、快速、分辨率高、重復性好等特點，被廣泛應用于布魯氏菌分型中[6-9]，是流行病學調查溯源的補充方法。本研究采用多位點串聯重復序列分析方法對寧夏68株布魯氏菌進行分型研究，闡述其分子特征，為布魯氏菌病疫情暴發溯源提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 一般材料：44株臨床分離菌株于2009-2013年從寧夏地區感染布魯氏菌現癥病人血液樣本中分離獲得，歷史保藏的24株菌株和16M、544A、1330S參考菌株由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所布病研究室提供，菌株鑒定與MLVA分型實驗在中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所完成。

1.2 試劑與儀器：法國BioMerieux,SA公司生產的雙相血培養瓶；上海生工生物工程股份有限公司合成的AMOS-PCR引物、MLVA-16引物，北京天一輝遠生物科技有限公司完成測序；DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑購自北京天根生化科技有限公司。儀器設備S1000TM型基因擴增儀、Universal HoodⅡ型凝膠成像儀由BIO-RAD 公司生產；DDY-6C 型電泳儀由北京六一廠生產。

1.3 方法

1.3.1 布魯氏菌培養分離：負壓雙相血培養瓶采集具有牛羊等動物接觸史、臨床癥狀和經血清學確診為感染布魯氏菌急性發作期病人血液3～5 mL，輕輕振蕩血培養瓶使液相培養基與血液充分混勻置于37 ℃恒溫培養箱中培養，每隔1 d觀察1次血培養瓶生長情況，并傾斜培養瓶使液相培養物浸沒固相培養基表面。如果固相培養基表面觀察到菌落生長時，挑取可疑菌落接種于布氏瓊脂平板傳代培養，如果液體渾濁挑取1環培養液接種于布氏瓊脂平板傳代培養觀察；如果無菌生長則繼續培養至30 d 左右，仍無菌生長，則高壓滅菌后按醫療廢棄物處置。

1.3.2 布魯氏菌鑒定

1.3.2.1 傳統生物學特性鑒定:根據培養特性、二氧化碳需求、菌落生長時間和形態觀察，革蘭氏染色和柯氏染色初步判定布魯氏菌。接種觀察硫堇、堿性復紅染料抑菌試驗，A、M(血清)單相特異性凝集和粗糙型R(血清)凝集試驗，Tb、BK2、Wb(噬菌體)裂解試驗。

1.3.2.2 AMOS-PCR方法鑒定: AMOS-PCR(AMOS是牛、羊、綿羊附睪和豬種布魯氏菌的英文名稱的第一個字母)引物按參考文獻的方法合成[10]。PCR反應體系:10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl,引物各0.5 μl(10 μmol/L)，Taq 酶1 μl(2.5 U),模板1 μl，去離子水14.5 μl。PCR反應程序:93 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，60 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min,共40個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，凝膠成像分析儀拍照分析。

1.3.3 MLVA分型：分型引物及擴增體系參考文獻[7]。MLVA反應體系：10×緩沖液2.5 μl，dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)，Taq 酶1 μl(2.5 U/μl)，引物各1 μl(10 pmol/μl)，DNA 模板1 μl，用滅菌蒸餾水補至25 μl。擴增參數:95 ℃ 預變性5 min，然后以 95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，進行40個循環。PCR產物電泳得到產物片段的大小，送基因公司進行毛細血管電泳測序。

1.4 統計學方法：根據 PCR 產物大小換算為重復單位數，采用 Bio Numerics 5.0軟件，利用非加權配伍組平均法(UPGMA)進行聚類分析。

2 結果

2.1 傳統生物學特性鑒定結果：利用雙相血培養瓶分離到可疑布魯氏菌后經單項特異性血清A、M和R凝集，染料抑菌，噬菌體裂解，CO2需求，H2S等試驗鑒定，近期臨床分離44株菌均為羊種生物3型布魯氏菌。歷史保藏菌株鑒定結果為：12株羊種布魯氏菌、3株牛種布魯氏菌和9株豬種布魯氏菌，見表1。

表1 寧夏布魯氏菌分離株生物學特性鑒定結果

菌株編號陽性血清特異性凝集血清RAM噬菌體裂解TbWbBK2菌株種/型分離地點宿主NX201209+-++--+羊3吳忠市病人NX201210+-++--+羊3吳忠市病人NX201301+-++--+羊3吳忠市病人NX201302+-++--+羊3銀川市病人NX201303+-++--+羊3吳忠市病人NX201304+-++--+羊3吳忠市病人NX201305+-++--+羊3吳忠市病人NX201306+-++--+羊3吳忠市病人NX201307+-++--+羊3鹽池縣病人NX201308+-++--+羊3吳忠市病人NX201309+-++--+羊3吳忠市病人NX201310+-++--+羊3鹽池縣病人NX201311+-++--+羊3鹽池縣病人NX201312+-++--+羊3鹽池縣病人NX201313+-++--+羊3鹽池縣病人NX201314+-++--+羊3鹽池縣病人NX201315+-++--+羊3鹽池縣病人NX201316+-++--+羊3鹽池縣病人NX201317+-++--+羊3平羅縣病人NX201318+-++--+羊3平羅縣病人NX201319+-++--+羊3鹽池縣病人NX201320+-++--+羊3吳忠市病人NX201321+-++--+羊3鹽池縣病人

2.2 AMOS-PCR鑒定結果：采用AMOS-PCR鑒定布魯氏菌，結果顯示羊種布魯氏菌均擴增出2條特異性片段，大小為731 bp和178 bp，牛種布魯氏菌擴增出2條特異性片段，大小為498 bp和178 bp，豬種布魯氏菌擴增出2條特異性條帶，大小為285 bp和178 bp。

2.3 MLVA分型結果：采用 MLVA-16 分型方法對68株布魯氏菌進行分析，經擴增電泳檢測合格后，PCR產物送公司進行毛細管電泳測序，用Bio Numerics 4.0軟件聚類分析后，按照相似度80%劃分，68株菌可被分為8大基因群、39個基因型。從種群分布看，68株菌按種分為3大群，56株羊種布魯氏菌共分為33個基因型，最多的在同一基因型中有7株布魯氏菌。9株豬種布魯氏菌分為3個基因型，3株牛種布魯氏菌分為3個基因型。在地區分布上具有明顯的地域性，近期分離羊種布魯氏菌各市、縣大部分均能處在同一基因型，尤其是吳忠市和鹽池縣分離的菌株均能聚在一起，平羅縣和紅寺堡各分離2株菌均處在同一基因型。

結合流行病學資料發現吳忠市分離的菌株NX201201和NX201206，NX201303和NX201305同為一家人，具有同樣的接觸史、發病時間，且分離菌株時間相同，與流行病學調查結果吻合。從時間分布看，近期分離的菌株大部分聚在一起，歷史菌株中發現NX79033、NX79085與近期紅寺堡分離菌株NX200905、NX201001處在同一基因型，提示具有本土傳染源引起感染存在的可能性。

3 討論

隨著畜牧業的發展，布病疫情有回升的勢頭，全國各地布病檢測陽性率和患病率逐年上升[11]。寧夏布病疫情與全國一致，也保持著上升的勢頭，2004-2010年的調查數據顯示，報告發病率從0.017/10萬上升到3.141/10萬，職業以農民居多，占69.94%，疫區范圍不斷擴大，地區分布不均衡，患者以男性青壯年為主[12]。2018年布病發病率達24/10萬以上，說明寧夏的布病疫情一直處于高發攀升水平。寧夏20世紀就開展了病原學監測工作，自1958年寧夏首次在軍馬場確診病人體內分離到羊種布魯氏菌后，至1989年該區共分離到布魯氏菌138株，包括4個種12個生物型，其中引起人體感染的主要種型為羊種布魯氏菌[13]。2009年寧夏開展布病病原學監測以來，主要菌型為羊種3型布魯氏菌，說明近期分離布魯氏菌種型與以往感染人體主要菌型一致。

近年來，不同的分子分型方法用于布魯氏菌分型，常用的有聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RELP)[14]、AMOS-PCR[15]、單核苷酸多態性研究(SNP)[16]、多位點序列分型(MLST)技術等[17]。MLVA技術用于布魯氏菌基因分型操作簡單，分辨力高和可重復性較高，實驗結果易于分析，可以追溯傳染源，確定流行趨勢。目前該方法已廣泛應用于結核分枝桿菌[18]、炭疽芽孢桿菌[19]、大腸埃希菌O157:H7[20]以及腸炎沙門菌[21]等一些細菌的分型分析。本研究采用Le Fleche P建立的布魯氏菌MLVA-16分型引物，對寧夏近期分離布魯氏菌和歷史菌株共68株進行分析，結果表明，按相似度80%劃分，68株菌可被分為8大基因群、39個基因型，表明寧夏目前流行的布魯氏菌存在豐富的基因多態性。從地理位置分析，寧夏與內蒙古、甘肅、陜西等省區接壤，周邊省區畜牧業發達，是寧夏的畜牧流動集散地，同時由于畜牧業的發展引進養殖動物，加之本土布魯氏菌病的流行，當地分離到的菌株顯示出豐富的基因多態性。根據實驗結果，結合病人發病時間、菌株分離時間、分離地區等流行病調查資料推斷，極有可能是同一傳染源造成不同接觸者的感染發病，具體到同一個基因型的其他菌株，還需要開展流行病學調查來更進一步做系統分析。

根據以上研究結果，通過 MLVA 分析可以及時掌握傳染源的流動，盡早控制、撲滅傳染源，為布病的防制提供有力的分子生物學依據，對布病傳染源追蹤、暴發流行調查等具有非常重要的意義。