利用選擇性清除方法鑒定牛繁殖性狀相關的候選基因

呂世杰，陳付英，張子敬，王李輝，張松山，王二耀，徐照學，施巧婷

(1.河南省農業科學院 畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002； 3.平頂山市動物疫病預防控制中心，河南 平頂山 467000； 4.平頂山市畜產品質量安全監測中心，河南 平頂山 467000)

牛繁殖性狀是重要的經濟性狀，對奶牛和肉牛產業發展具有重要意義。繁殖性能好的母牛表現為適時發情和易受孕，能夠節約飼養成本，提高生產效率。繁殖性能的優劣不僅關系到牛群的數量，而且關系到整個牛群的經濟效益。

現代奶牛生產中，隨著對產奶性狀的高強度選擇，奶牛的繁殖性狀呈現衰退趨勢[1]，因繁殖性能差而被淘汰的奶牛數量增加[2]。改良奶牛繁殖性能成為育種工作者重要的研究內容，也被認為是奶牛未來選育的重要方向[3-4]。繁殖性狀是復雜的數量性狀，受到多個基因的控制，大多數繁殖性狀遺傳力的估計值較低(約為5%)[5]。在奶?；蚪M選擇時,增加選擇指數中繁殖性狀的比例能夠減緩繁殖性能的衰退趨勢，說明繁殖性狀仍可通過選種選育進行提升[4]。因此，研究人員一直在進行繁殖性狀的QTL定位，并希望能夠將QTL信息加入到基因組選擇的模型中以提高選種的準確性。目前，依據動物QTL數據庫(Animal QTLdb)[6]，通過關聯分析共發現17 867個QTLs與繁殖性狀有關，但是主效基因仍不明確。

選擇性清除是指在自然選擇或人工選擇過程中，群體內某些優勢等位基因的頻率增加，其周圍與之連鎖的染色體區域因搭車效應而出現多態性下降的一種現象。利用全基因組分析獲得不同牛品種全基因組水平的選擇性清除及品種間差異的基因組區域，并借此鑒定牛重要經濟性狀相關候選基因已成為可能[7-8]。利用選擇性清除方法，通過對比高低繁殖力品種間的基因組差異，可進行牛繁殖性狀候選基因鑒定，或對關聯分析結果進行有益補充。

郟縣紅牛作為我國優良的地方黃牛品種，具備適應性強和繁殖力高等特點[9-10]，可考慮用來作為奶牛的比較群體進行牛繁殖性狀候選基因鑒定。利用簡化基因組測序(Specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)技術對中國荷斯坦奶牛和郟縣紅牛進行全基因組SNP檢測與分型，通過比較2個品種間差異的基因組區域，鑒定牛繁殖性狀相關的候選基因組區域及候選基因，以期為牛繁殖性狀相關的主效基因鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇97頭郟縣紅牛母牛(J)和32頭中國荷斯坦奶牛母牛(D)為試驗對象。郟縣紅牛來源于河南省平頂山市郟縣紅牛良種繁育中心，中國荷斯坦奶牛來源于河南省鄭州市周邊2個奶牛場。

1.2 DNA提取

通過尾靜脈采集每頭供試牛血樣。使用DNeasy Blood & Tissue試劑盒(Qiagen 公司,德國)提取血液總DNA。檢測DNA質量和完整性，樣品純度要求A260/A280介于1.8～2.0。

1.3 SLAF-seq

通過SLAF-seq對試驗個體進行測序以獲得全基因組SNP標記[11]。以?；蚪M(UMD 3.1)作為參考序列進行測序及分析，篩選保留位于常染色體上最小等位基因頻率(Minor allele frequency)大于0.05和檢出率(Call rates)大于0.8的SNP位點[12]。

1.4 選擇性清除分析

在每條染色體上使用100 kb的滑動窗口及10 kb的步長檢測選擇性清除區域。采用R語言(3.4.1)的PopGenome軟件包計算各滑動窗口內SNP位點的遺傳分化系數(Fst)值和核苷酸多態性(π ratio)值，判斷該滑動窗口是否受到選擇。將Fst值和π ratio值(π奶牛/π郟縣紅牛)的99%分位數對應的值分別作為閾值，篩選2個品種間差異的基因組區域，然后對所得區域取交集。將重疊的滑動窗口合并為1段基因組區域。

1.5 候選基因篩選

將通過選擇性清除方法篩選得到的基因組區域與Animal QTLdb(release 38)中牛QTLs進行比對，與繁殖性狀QTL重合的區域作為候選基因組區域。利用R語言進行數據分析，通過biomaRt軟件包的篩選功能獲得候選基因組區域內的基因(參考基因組為UMD 3.1)。在Animal Omics數據庫中查看候選基因在母牛繁殖相關組織間的表達情況(http://animal.nwsuaf.edu.cn)。該數據庫中，與母牛繁殖相關的組織樣本有卵巢(Ovary)、輸卵管壺腹部(Ampula)和黃體(Corpus luteum)。根據區域內基因在這3種組織中的表達情況繪制基因表達情況圖并進行聚類分析(https://software.broadinstitute.org/morpheus)。以FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值表示基因表達情況，根據基因表達量之間的Spearman相關系數進行聚類。如果FPKM>1，認為基因在該組織中表達，FPKM>10則為高表達[13]。

2 結果與分析

2.1 SNP標記開發與篩選

對?；蚪M進行電子酶切預測后確定使用RsaⅠ和HaeⅢ進行酶切，酶切片段長度在414～444 bp的序列定義為SLAF標簽。本試驗共開發232 030個SLAF標簽，平均測序深度為6.1×，經篩選后共得到30 233個SNP。

2.2 利用選擇性清除方法分析2個牛品種間差異的基因組區域

Fst值和π ratio值的99%分位數分別為0.39和1.49。因此，選取Fst值大于0.39且π ratio值大于1.49的基因組區域為2個牛品種間差異的基因組區域。經過篩選，共得到了42個基因組區域和100個區域內基因。將得到的基因組區域與Animal QTLdb(release 38)的牛QTL數據庫對比后，發現與291個已知QTL重合。在這42個候選區域內共有11個基因組區域與26個繁殖性狀QTL重合(圖1、表1)。

藍色點是以Fst值和π ratio值均大于99%分位數篩選得到的區域Blue dots mean the regions with Fst and π ratio values which were greater than 99th percentile of genome-wide values圖1 郟縣紅牛和中國荷斯坦奶牛品種間差異的基因組區域Fig.1 Diverged genomic regions between Jiaxian Red cattle and Chinese Holstein cattle

2.3 利用基因表達量篩選候選基因區域內基因

與繁殖性狀QTL重合的11個基因組區域共包含20個基因，其中14個基因功能已注釋，且在Animal Omics數據庫中有組織表達數據。依據FPKM>1篩選，共有9個基因在卵巢、輸卵管壺腹部或黃體中表達(圖2)。其中，有8個基因在卵巢中表達，7個基因在輸卵管壺腹部中表達，5個基因在黃體中表達。CFDP1、CFDP2和FAM204A基因在各組織中均高表達(FPKM>10)。CFDP2與FAM204A基因聚為一類，表明二者具有相似的表達模式。

表1 郟縣紅牛和中國荷斯坦奶牛品種間與繁殖性狀相關QTL重合的高差異基因組區域Tab.1 Highly diverged genomic regions between Jiaxian Red cattle and Chinese Holstein cattle which overlap with QTLs of reproductive traits

標示的數字為FPKM值 The labeled number means the FPKM value圖2 候選基因組區域內基因在母牛繁殖相關組織中的表達情況Fig.2 Expression statues of genes within the candidate regions in tissues related to cattle reproduction

3 結論與討論

本研究利用SLAF-seq技術對郟縣紅牛(母牛)和中國荷斯坦奶牛(母牛)進行了全基因組SNP的開發，利用選擇性清除方法篩選了2個品種間差異的基因組區域(Fst>0.39,π ratio>1.49)。共篩選得到42個基因組區域和100個區域內基因，其中11個基因組區域與26個繁殖性狀QTL重合。在這11個基因組區域中，共有9個基因在母牛繁殖相關組織中表達。CFDP1、CFDP2和FAM204A基因在繁殖相關各組織中均高表達，可考慮優先作為牛繁殖性狀相關候選基因。

CFDP1和CFDP2基因位于牛18號染色體。前人研究發現，18號染色體含有1個影響牛繁殖性能的關鍵QTL(44～62 Mb)，與懷孕率、產犢能力等性狀有關[4,14]。CFDP1基因編碼顱面發育蛋白1，與脊椎動物的顱面發育和成骨細胞生成有關[15-16]，并可能在胚胎發育過程中發揮作用[17]。在人類醫學研究中，顱面發育異常的研究意義非凡，因為顱面發育異常往往會造成嬰兒殘疾或者死亡[18]。CFDP1基因在顱面發育中的重要作用提示其在生物體發育過程中扮演重要角色。該基因在動物繁殖過程中同樣發揮作用，在小鼠胚胎中，通過原位雜交，發現該基因在胚胎發育早期(E8)廣泛表達，并可能參與腦、心臟、肺臟等多種組織的發育[19]。在小鼠子宮胚胎著床點，CFDP1基因表達量相較于非著床點顯著上調，表明該基因可能對胚胎子宮內著床起到調控作用[20]。根據Animal Omics Database中的基因表達數據，發現CFDP1基因在母牛繁殖相關組織中高度表達，并在卵巢中表達最高，也表明了該基因在動物繁殖過程中可能發揮的重要作用。根據選擇性清除分析結果，CFDP1基因位于2個品種間高度差異的基因組區域(18號染色體:2 720 001～2 840 000 bp)，并處在懷孕率、第1次配種受胎率和產犢指數等性狀相關的QTL區域內?？梢?，CFDP1基因可能與動物繁殖性能相關，可優先考慮為牛繁殖性狀相關候選基因。CFDP2為反芻動物所特有，是CFDP1的重復基因，比CFDP1基因多插入了1個轉座子Bov B-LINE，二者都屬于祖先基因Bucentaur(BCNT)的重復基因[21]。CFDP2基因最早在牛大腦組織中發現[22]，但是其生物學功能還不明晰。根據CFDP2基因的表達情況和位置信息，認為CFDP2基因可能也參與牛繁殖調控，這是對該基因生物學功能的有益補充。此外，BCNT2也為BCNT家族的基因，在本試驗中的3種繁殖相關組織中有表達，提示 BCNT基因家族可能參與牛的繁殖調控。BCNT家族大約在20 a前在牛中發現，其在發育過程扮演重要角色，并可能影響染色質結構[23]。上述基因或BCNT基因家族是否確參與牛繁殖調控仍需進一步驗證。FAM204A基因位于牛26號染色體，具體生物學功能尚不清楚，與CFDP2基因表達模式類似，其可能也參與繁殖調控。有研究指出，雞FAM204A基因與第1次產蛋年齡相關[24]，提示該基因具有作為繁殖性狀候選基因的可能性?？傮w而言，根據本試驗研究結果，CFDP1、CFDP2和FAM204A基因可優先考慮為牛繁殖性狀相關的候選基因，但是由于繁殖性狀的復雜性和基因功能研究的片面性，不能排除其他候選區域內基因為主效基因的可能性。

中國荷斯坦奶牛是19世紀末期由中國的黃牛與當時引進我國的荷斯坦牛雜交的品種，郟縣紅牛為中國地方黃牛品種，二者在遺傳背景上差異較大。在進行基因組對比中，遺傳背景的較大差異會增加結果的復雜性和假陽性。本試驗篩選得到的42個基因組區域，不僅與繁殖性狀有關，還與產奶、生長、抗病等多種性狀有關。通過與繁殖性狀QTL比對篩選了11個基因組區域，這些區域是否確與繁殖性狀有關，有待通過對候選基因的驗證以進一步證實。

綜上，本研究通過比較郟縣紅牛和中國荷斯坦奶牛2個品種間差異的基因組區域，獲得了11個與繁殖性狀相關的基因組區域，包含9個在卵巢、輸卵管壺腹部或黃體中表達的基因。其中，CFDP1、CFDP2和FAM204A基因可優先作為牛繁殖性狀相關候選基因進行進一步驗證研究。