FCM聯合多重PCR技術在慢性淋巴細胞白血病基因異常檢測中的效果分析

顧嬌靈 蔣偉光

（丹東市第一醫院檢驗科，遼寧 丹東 118000）

近年來我國慢性淋巴細胞白血病發病率逐漸提升，對其的診治研究越來越受到重視，而如今研究證實腫瘤發生與抑癌基因失活關聯較大，因此需深入研究，結合疾病生物學特征和臨床過程探索可靠的治療方案[1]。如疾病病程為穩定性、惰性發展過程則無需藥物治療，若疾病進程較快，則需積極治療[2]。FCM作為造血系統和淋巴系統腫瘤診斷的可靠方法，具有細胞免疫分型精確優勢，配合多重PCR技術，可檢測基因的突變，準確檢測癌基因的表達量，實現對患者的個性化治療[3]。為此，本次研究對FCM聯合多重PCR技術在慢性淋巴細胞白血病基因異常檢測的效果進行了探討，詳細報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年4月至2018年4月本院收治的慢性淋巴細胞白血病患者52例作為觀察組，另選擇同時間段本院接收健康體檢者52例作為對照組，均知曉本次研究內容及目的，且自愿簽署知情同意書。觀察組均滿足《血液病診斷及療效標準》[4]相關標準，其中男患者31例，女患者21例，年齡在40～78歲，平均年齡為（62.25±3.42）歲，Binet分期：A期33例，B期12例，C期7例；對照組男患者29例，女患者23例，年齡在37～76歲，平均年齡為（62.05±3.41）歲。兩組性別、年齡等基本資料比較無明顯差異，P＞0.05。

1.2 檢測方法：均取外周血標本和骨髓標本進行檢驗：①FCM：胞膜染色取100 μL肝素抗凝骨髓與20 μL單克隆抗體混合，再加入溶紅細胞素2 mL，溶解紅細胞10 min，隨后采用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入牛血清白蛋白。胞質和胞膜染色在溶解紅細胞10 min后，加入透膜劑0.5 mL，靜置10 min，采用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，加入胞質抗體20 μL，避光15 min，離心處理，加入牛血清白蛋白。均于24 h內完成檢測工作，采用FACsort流式細胞儀檢測，計算CD45+、CD19+、CD34+、CD10+等百分數，并觀察CD19+細胞各亞群細胞分布情況。敏感度檢測，選擇1例初治免疫分型為CD45-/CDstrong10/CD34+/CD19+的B-ALL患兒初治骨髓標本作為陽性對照組，比例為1:1000、1:10000，依據正常骨髓供者的單個核細胞混合后急性檢測。②多重PCR檢測：采用TRIZOL一步法抽提RNA，逆轉錄反應體系：RNA 2 μg.oligo dT 1 μL（0.5 μg/L）.5×Buffer8 μL，dNTP（40 mmol/L）2 μL，AMV10U（1 μL），RNAsin40 U（1 μL）.DTT（100 mmol/L）1 μL加DEPC水至40 μL，70 ℃，10min；冰上至少10 min；42 ℃，1 h；95 ℃，5 min；冰浴5 min，-80 ℃保存。IgVH片段由3個框架區、兩個抗原互補決定區組成。PCR反應體系：MIX I或MIX Ⅱ45 μL，Tap DNA聚合酶1 U（0.25 μL），cDNA模板5 μL，共50 μL反應體系，反應條件：94 ℃，7 min；94 ℃，45 s；60 ℃，45 s；72 ℃，90 s擴增35個循環，72 ℃10 min。以相同條件擴增試劑盒提供的陽性和陰性對照組。PCR產物分析采用未純化PCR原液直接測序，并采用IMGT/V-QUEsT數據庫分析，明確有無基因突變及突變位置。

1.3 統計學處理：采用SPSS19.0統計學軟件進行處理分析，計數資料采用百分數（%）表示，采用卡方檢驗，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為統計學有意義。

2 結果

2.1 兩組T細胞各亞群細胞表達水平比較：分析表1可知，觀察組CD45+、CD19+細胞百分率顯著低于對照組，而CD34+、CD10+細胞百分率則顯著高于對照組，P＜0.05。

2.2 不同特征患者IgVH基因重排陽性率分析：分析表2可知，不同性別、不同年齡患者IgVH基因重排陽性率比較無顯著性差異，P＞0.05。

表1 兩組T細胞各亞群細胞表達水平比較（%，±s）

表1 兩組T細胞各亞群細胞表達水平比較（%，±s）

表2 不同特征患者IgVH基因重排陽性率分析

3 討論

白血病作為嚴重危害人類健康及生命安全的血液科惡性腫瘤疾病，對其的盡早發現及治療極為重要[5-9]。慢性淋巴細胞白血病作為因細胞凋亡受阻而導致的B細胞惡性克隆增值性疾病，臨床特征為成熟的小淋巴細胞在外周血、骨髓及其他淋巴組織中異常積聚，導致患者出現貧血、無痛性淋巴結腫大或肝脾大等癥狀，且促使其免疫功能低下[10-12]。隨著醫療技術發展，如今診斷慢性淋巴細胞白血病除了單純外周血細胞淋巴計數和血涂片外，應借助免疫表型、骨髓活組織檢查。如今實時熒光定量PCR可有效檢測基因的突變和癌基因的表達量，可進行慢性淋巴細胞白血病WT1基因，腫瘤ER基因等多種基因的表達檢測[13-15]。流式細胞儀可依據白血病細胞所表達的細胞種系抗原，結合單克隆抗體檢測白血病細胞表面的免疫標識，分析細胞的來源和分型[16-18]。而且其還可進行抗原組織檢測，利用熒光密度進行白細胞細胞的判斷，為疾病治療及預防提供可靠的依據[19]。本次研究結果顯示觀察組CD45+、CD19+細胞百分率顯著低于對照組，而CD34+、CD10+細胞百分率則顯著高于對照組，P＜0.05；不同性別、不同年齡和不同分期患者IgVH基因重排陽性率比較無顯著性差異，P＞0.05，表明FCM聯合多重PCR技術檢測具有定量分析作用，且熒光檢測具有靈敏度高，自動化程度高等特征，為細胞移植成功及白血病惡性腫瘤治療提供可靠依據。

綜上所述，FCM聯合多重PCR技術在慢性淋巴細胞白血病基因異常檢測的價值較高，為治療白血病及療效評價提供可靠依據，值得推廣應用。