長柄扁桃與蒙古扁桃幼苗抗旱性比較研究

張高如，賈東波，李奔奔，韓瑞瑞，李嘉麗，段義忠，柴乖強

(1.榆林市林業產業開發中心,陜西 榆林 719000；2. 榆林學院 生命科學學院,陜西 榆林 719000)

隨著全球氣候變暖，許多國家和地區都面臨著不同程度的干旱、高溫等非生物威脅，其中在干旱、半干旱自然環境植物生長過程中最依賴的是水分[1-2]。研究表明，高溫和水分虧缺嚴重威脅著植物的正常生長和發育。為了應對逆境脅迫，植物會通過關閉氣孔，維持體內細胞的滲透壓進而繼續進行細胞的代謝活動，如植物體內應答干旱脅迫的各種途徑被激活如多酚氧化酶參與植物的干旱調節，從而減輕干旱對植物所造成的影響[3-4]。所以，從生理層面講，增強植物抗旱性并提高水分利用率的一種行之有效的途徑是減緩蒸騰速率。因此，篩選耐旱植物對干旱、半干旱地區植物資源的發展有深遠意義。

長柄扁桃(Amygdalus pcdunculata Pall)和蒙古扁桃(Amygdalus mongolica (Maxim.) Ricker)因具有耐瘠薄、抗干旱、耐寒冷及適應性強等優點，是亞洲干旱地區防風固沙、水土保持的先鋒樹種，在荒山造林以及沙地治理等方面具有重要的功能，因而已經成為國內外研究的熱點。但當前有關扁桃屬的研究主要集中在沙漠化治理、藥用成分的開發與利用、食用油的開發、地理分布與進化和功能基因的發掘等方面[5-7]，對于長柄扁桃和蒙古扁桃抗旱的生理生化特征研究尚不清晰。本項目在前期研究發現長柄扁桃和蒙古扁桃抗干旱性都較強的基礎上，擬采用生理生化指標測定、光合測定系統等，探究干旱脅迫對扁桃種子萌發和幼苗的損傷機理及扁桃的抗逆機制，總結兩種扁桃應對干旱脅迫的生理特性響應及其變化規律，為加強干旱半干旱地區抗旱植物資源開發利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1 植物材料

長柄扁桃與蒙古扁桃，采集于陜西省榆林市孟家灣(109°35' 50″E，38°41'42″N)的新鮮度過休眠期的種子，并于榆林學院生命科學學院地理與生態學試驗室保存。長柄扁桃和蒙古扁桃種子經過夾破核殼和剝除核殼處理，并在體積濃度為10%的NaClO溶液中消毒處理10～15 min，后用蒸餾水沖洗4～5次，作為種子萌發及生理指標測定的材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 PEG-6000模擬干旱脅迫處理長柄扁桃種子

長柄扁桃種子的萌發試驗參考譚春燕等[8]的方法，并做了部分修訂。改進的方法如下：取15個直徑15cm的大號玻璃培養皿，鋪上定性濾紙。挑選750粒破殼且飽滿的扁桃種子，放入培養皿中，每個培養皿放置50粒；分別用量筒量取15 mL質量分數為0%，5%，10%，15%和20%的PEG-6000溶液，每一個處理做3個平行重復，所有處理放置于光照培養箱中，培養溫度統一為25℃。

發芽試驗自第一天起每天定時(9點至12點)觀察種子發芽狀態(規定扁桃種子胚根露出大約2 mm視為發芽)并做統計記錄，每天觀察統計后，要更換培養皿中的PEG-6000溶液，同時，每3 d更換一次濾紙，以保持溶液滲透勢恒定，連續進行25 d的跟蹤觀察，每天如實記錄扁桃種子發芽狀態并計算種子發芽率、發芽勢以及發芽指數。計算參考何學青等[9]方法，其計算公式如下：

發芽率(%)= 已經發芽的種子數目/處理的種子數量×100；

發芽勢(%)= 規定時間內發芽種子粒數/供試種子粒數×100；

種子活力指數VI=GI×S，S為處理第15天時的幼苗高度。

1.2.2干旱脅迫處理長柄扁桃幼苗

挑選飽滿的長柄扁桃種子，機械夾破外表的種皮殼、用10%的次氯酸鈉消毒處理10 min，無菌水沖洗5～6遍，用0.15%的雙氧水催芽后播種至花盆中，每一花盆種6株，每個處理種植5盆，總共25盆。扁桃材料放置于玻璃科研溫室中，溫度控制在25℃左右，前期各個處理水、肥、光等管理保持統一，等到長柄扁桃幼苗長至20 cm高時(約兩個月后)，進行干旱脅迫處理。水分處理設置參考宋吉軒博士論文，并做了一定修改，處理主要分為：輕度干旱脅迫(Light stress，LS)，中度干旱脅迫(Mild stress，MS)和重度干旱脅迫(Severe stress，SS)。

長柄扁桃苗期各個生理生化指標測定參考方法如下：光合速率的數據采集參考儀器說明書進行；植物葉片表皮氣孔的觀察參考Groll[10]的方法進行；幼苗葉片葉綠素含量測定采用80%的乙醇法；過氧化物酶(peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，測定的具體方法參照孫群和胡景江[11]，每一個生理、生化指標均重復測定3～4次。

1.2.3干旱脅迫處理下扁桃幼苗葉片氣孔的開張度檢測及表皮蠟質的測定

為了檢測各種脅迫條件下兩種扁桃幼苗葉片氣孔的開張程度，在三種干旱脅迫處理1～2小時后，用尖頭鑷子撕下扁桃葉片的下表皮層，放到載玻片上，在攜帶有照相機的光學顯微鏡下觀察各個處理的氣孔情況，顯微鏡的放大倍數為100×。

柄扁桃蠟質的提取方法參考柴乖強學位論文中的方法[12]。提取好的蠟質，在試驗室抽風機內自然風干后，用千分之一天平稱重。

1.3 數據處理與分析

試驗中各數據均應用Excel 2016和DPS軟件進行統計分析。采用單因素One-way ANOVA和Duncan進行差異顯著性分析，并應用Sigmaplot 12.5進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1不同PEG-6000濃度對長柄扁桃和蒙古扁桃種子萌發期形態指標的影響

從表1可以看出，隨著PEG6000濃度的逐漸增大，長柄扁桃和蒙古扁桃兩個品種的發芽率和發芽勢呈現出顯著降低的趨勢(P<0.01)，當脅迫濃度達到20%時，兩者均達到最低；發芽勢、發芽指數、活力指數、幼苗高度、幼苗根長和幼苗鮮重隨著PEG濃度增大，均呈現出先緩慢增高后顯著降低的趨勢，其中，PEG-6000濃度為5%時，各個指標均達到最大值，但與對照相比均沒有顯著差異，說明5%的PEG處理有助于長柄扁桃和蒙古扁桃的發芽生長，但當脅迫加大后，種子的受害程度逐漸加大，萌發率、發芽指數等極顯著降低(P<0.01)。

表1 滲透脅迫對長柄扁桃種子萌發期形態指標的影響

注: 不同小寫字母表示不同水平間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同水平間差異極顯著(P<0.01)，下同。

從兩個品種長柄扁桃和蒙古扁桃的對比來看，PEG處理后，兩個品種的種子萌發指標表現出相似的規律。在重度脅迫下(20% PEG-6000)，從發芽率、發芽指數、活力指數和幼苗根長等方面，蒙古扁桃的形態表現要比長柄扁桃較好。綜合種子萌發過程中的各種形態指標，初步確定了蒙古扁桃的抗旱性能要比長柄扁桃強。

2.2 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗生理特性的影響

2.2.1不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗株高的影響

對培養約45 d的長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗進行不同程度的干旱脅迫處理，處理結束后，分別對其進行株高的測量，結果表明(圖 1)，隨著干旱脅迫的加重，長柄扁桃和蒙古扁桃的株高有所降低，但和對照相比沒有顯著性的差異(P>0.05)。兩個品種比較后發現，長柄扁桃收到重度脅迫后，株高降低的更快，表明長柄扁桃對干旱脅迫表現比蒙古扁桃要敏感。

圖1 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗株高的影響

2.2.2 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗凈光合速率的影響

為了探明干旱脅迫對沙生植物扁桃屬植物凈光合速率的影響，我們利用光合儀測定了不同干旱脅迫處理下的扁桃光合速率，結果表明(圖 2)，隨著干旱脅迫的逐漸加重，長柄扁桃和蒙古扁桃的凈光合均呈現出先保持穩定變化后迅速降低的趨勢。特別在中度脅迫和重度脅迫下，光合速率顯著地低于對照(P<0.05)。

圖2 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗葉片凈光合速率的影響

2.2.3不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗氣孔變化的影響

研究表明，植物在熱、干旱、高鹽等非生物逆境脅迫下，作出的響應之一是調控葉片表皮氣孔的開張度來減少水分的散失。本試驗通過對長柄扁桃和蒙古扁桃的干旱脅迫處理，發現在輕度干旱下，蒙古扁桃和長柄扁桃氣孔沒有關閉，當中度和重度干旱脅迫時，兩種材料表皮氣孔發生關閉或微張(圖 3)。與長柄扁桃相比，蒙古扁桃在中度干旱脅迫下，仍有部分表皮氣孔微微張開，依然能夠發生蒸騰作用，說明蒙古扁桃對干旱脅迫的適應性要比長柄扁桃要強。

圖3 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗葉片氣孔的影響

2.2.4不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗脯氨酸含量的影響

前人研究表明，脯氨酸是逆境脅迫下生物體特別易積累的一種氨基酸之一，也能夠作為一種滲透調節物，參與穩定蛋白結構及保護細胞內生物大分子等作用。同時，在同一逆境脅迫下，不同生物體表現出較大的差異性。本試驗研究表明(圖4)，沙生孑遺植物扁桃兩個亞種長柄扁桃和蒙古扁桃在三種不同脅迫處理下，隨著干旱加重，脯氨酸呈現出先穩定不變后迅速升高的趨勢，特別是在中度脅迫(LS)和重度脅迫(SS)下，兩個品種的脯氨酸含量極顯著地高于對照(P<0.01)，且在重度干旱下，蒙古扁桃積累的脯氨酸要比長柄扁桃高，說明其抗旱能力要略強。

圖4 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗脯氨酸含量的影響

2.2.5 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物有機溶質的碳架和能量的主要來源之一，同時也作為多種生物體的滲透調節劑，參與細胞膜和原生質膠體的穩定形成。一般條件下，植物體內可溶性糖含量較低，但在生物脅迫或非生物逆境下，可溶性糖會在細胞中大量累積，為植物的各種新陳代謝提供較為穩定的內環境。研究表明，可溶性糖主要參與細胞的滲透調節作用，其含量可在一定程度上反映植株的耐旱性能。如圖5所示，在輕度脅迫下，兩種扁桃的可溶性糖含量開始顯著升高(P<0.05)，隨著脅迫程度加強，在中度和重度脅迫下，長柄扁桃和蒙古扁桃的可溶性糖含量迅速升到很高的水平，且極顯著的高于對照(P<0.01)，特別是在重度干旱下，可溶性糖含量已經是對照的3-4倍以上，說明干旱處理顯著促進了長柄扁桃的可溶性糖的積累。

圖5 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗可溶性糖含量的影響

2.2.6 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗葉綠素含量的影響

植物葉綠素的含量在一定程度上亦能反映出植物體是否遭到或遭受到多大生物非生物逆境脅迫的威脅。由圖6可以看出，兩種長柄扁桃在不同程度的干旱脅迫下，葉綠素含量呈現出先穩定不變后逐漸升高最后又緩慢回落的變化趨勢。在輕度脅迫下，兩種扁桃葉綠素含量沒有受到影響，當中度干旱脅迫后，可能是植物的細胞膜遭到破壞，葉綠素浸提速率極顯著升高(P<0.01)，當干旱進一步加劇后，植物可能產生了某種生理防御機制來抵抗外界脅迫，從而使得葉綠素浸提速率有所回落。

2.2.7 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗POD含量的影響

過氧化物酶(POD)是生物體內普遍存在且活性較高的一種酶之一，其可催化過氧化氫、氧化酚類等化合物，參與消除氧代謝中產生的過氧化氫和酚類、胺類等毒性物質，進而起到解毒的作用，是植物體內重要的的保護酶之一。由圖7可以看出，兩種長柄扁桃在不同程度的干旱脅迫下，POD量呈現出逐漸升高的變化趨勢。在輕度脅迫下，兩種扁桃POD含量顯著增高(P<0.05)，當中度干旱脅迫后，兩個品種的POD含量極顯著升高(P<0.01)，當重度脅迫后，材料的POD含量達到最大值，為對照的5～5.5倍。

圖6 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗葉綠素含量的影響

圖7 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗POD含量的影響

2.2.8 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗SOD含量的影響

圖8 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗SOD含量的影響

SOD( 超氧化物歧化酶) 是植物體內重要的保護氧自由基對細胞膜系統傷害的金屬酶類。由圖8可以看出，兩種長柄扁桃在不同程度的干旱脅迫下，SOD含量呈現出先升高后降低的變化趨勢。在輕度脅迫下，長柄扁桃和蒙古扁桃SOD含量顯著增高(P<0.05)，當中度干旱脅迫后，兩個品種的SOD含量極顯著升高(P<0.01)，并且達到最大值，此時SOD含量分別為對照處理的3.3倍和3.9倍。當重度脅迫后，長柄扁桃和蒙古扁桃的SOD含量逐漸降低，說明此時干旱脅迫已經造成了細胞膜的嚴重破壞。進一步說明長柄扁桃幼苗能在水分脅迫下SOD活性維持在較高的水平，這對防止活性氧的大量積累，降低膜質過氧化程度，減輕膜傷害具有重要作用。

2.2.9 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗MDA量的影響

MDA是膜脂過氧化的產物其含量的高低可以作為細胞膜系受損傷程度的指標之一，也是衡量植物抗性強弱最直觀的反應指標。研究表明，干旱脅迫下植物細胞膜受到損傷后會產生大量自由基，促進了MDA含量升高。由圖9可以看出，兩種長柄扁桃在不同程度的干旱脅迫下，MDA含量呈現出逐漸升高的變化趨勢。在輕度脅迫下，長柄扁桃和蒙古扁桃MDA含量顯著增高(P<0.05)，當中度干旱脅迫后，兩個品種的MDA含量極顯著升高(P<0.01)，當達到重度脅迫時，長柄扁桃和蒙古扁桃的MDA含量達到最大值，分別為對照處理的5倍和4.5倍。

圖9 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗MDA含量的影響

2.2.10 不同干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗CAT含量的影響

過氧化氫酶(CAT)普遍存在于植物組織中，是一種酶類清除劑，又稱為觸酶。其主要功能是參與清除植物體內的過氧化氫，從而使細胞免于H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。由圖10可知，長柄扁桃幼苗的CAT活性隨著干旱脅迫的增加而呈現出上升趨勢，不同基因型扁桃在受到干旱脅迫后，長柄扁桃的CAT活性總是略低于蒙古扁桃，但差異不顯著(P>0.05)。進一步說明重度干旱脅迫時會對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗造成嚴重傷害并引起幼苗CAT活性的顯著上升。

圖10 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗CAT含量的影響

2.3 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗葉片表皮蠟質總量的影響

植物體對逆境脅迫的重要響應之一是調控并分泌蠟質到植物表皮層，并形成不同類型的蠟質晶體。我們的研究表明(圖11)，當長柄扁桃和蒙古扁桃遭受到不同程度的干旱脅迫后，其蠟質總量發生了變化，其變化規律是：總蠟質含量隨著干旱脅迫的加深呈現出先穩定不變后顯著升高的規律，當中度脅迫后，蠟質總量達到最大值。說明只有植物在中度和重度脅迫條件下，長柄扁桃和蒙古扁桃的表皮蠟質才能體現出抗旱保水的作用來。此外通過對兩個品種的比較，發現在中度和重度干旱脅迫下，蒙古扁桃表皮蠟質的積累量要高于長柄扁桃(圖11)，因此，單從蠟質積累方面說明了蒙古扁桃對干旱的適應性要比長柄扁桃好。

圖11 干旱脅迫對長柄扁桃和蒙古扁桃幼苗表皮蠟質積累的影響

3討論與結論

3.1 干旱脅迫對長柄扁桃與蒙古扁桃種子萌發的影響

植物在生長和發育過程中受多種非生物脅迫(如干旱、高溫、高鹽等)的影響，其中，干旱是限制植物生長發育的主要非生物因素。在世界范圍內的許多農業領域水分缺少顯著限制植物的生長和產量。干旱作為植物所遭受的所有非生物脅迫中損害最為嚴重的不利因素，直接影響世界農業的生產。種子萌發是植物生長發育階段關鍵達的環節之一，種子萌發策略對荒漠地區植物的種群更新及植被恢復都具有重要意義。

目前國內外學者采用PEG模擬干旱脅迫在牧草、黃麻、黃瓜、亞麻等作物的種子抗旱性方面研究較多。而在長柄扁桃和蒙古扁桃抗旱綜合性研究等方面還未見報道，因此，本研究先采用PEG模擬干旱脅迫對抗旱能力都較強的長柄扁桃和蒙古扁桃種子萌發過程中的抗旱能力進行研究，以期篩選出抗旱性更強的材料，為揭示長柄扁桃耐瘠的分子、生理機制，加強干旱半干旱地區抗旱植物的種植利用提供科學依據。結果表明，輕微的干旱不會對種子的萌發產生重要影響，相反會促進兩種扁桃種子的萌發及成苗過程，這與姜生秀等研究沙冬青的結果一致。然而中度和重度脅迫條件下，兩種扁桃的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、幼苗高度、根長和幼苗鮮重均表現出極其相似的規律，即隨著干旱脅迫的加重表現為各形態學指標受抑制程度越明顯。另外在同等條件的干旱脅迫下蒙古扁桃受抑制程度要小于長柄扁桃，進而得出初步的結論：蒙古扁桃的抗旱性要高于長柄扁桃。

3.2 不同干旱脅迫對兩種扁桃幼苗生理生化指標的影響

植物在不同的生育期對外界環境都有不同的響應，苗期抗旱性研究是其中最重要的組成部分。植物體在不同的逆境條件下，很多生理生化指標如株高、凈光合速率、氣孔開張度、葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、POD、SOD、MDA和CAT等都會發生不同程度的變化。前人研究表面，植物的抗旱性與以上各種指標密切相關。本項目在前期研究發現兩種不同的扁桃屬植物抗旱性很強的基礎上，擬對其在不同干旱脅迫下的抗旱生理生化指標進行測定，結果表明，在輕度、中度和重度脅迫條件下，除光合速率、株高和氣孔開張度外，其他7種生理指標均表現出迅速增長的趨勢，這與前人在小麥、多油辣木和藜麥上的研究結果相似[13-15]。在逆境脅迫加大的情況下，長柄扁桃和蒙古扁桃的凈光合速率呈顯著下降趨勢；株高也呈現出降低的趨勢，但不顯著。

此外，研究在長柄扁桃和蒙古扁桃上測定了其葉表皮氣孔隨著干旱脅迫的變化情況，結果表明，隨著干旱脅迫的不斷加重，葉表面氣孔呈現出先穩定不變后迅速關閉的趨勢，但在兩種材料上亦存在差異，即蒙古扁桃在中度干旱下，氣孔沒有完全關閉，表明其還能進行光合作用，說明蒙古扁桃對中度脅迫具有一定的抵御能力，這與Guo等[16]研究結果相似。

作為生物體最外層的表面，植物表皮層蠟質是與外界環境密切接觸的直接部位，它對植物與外界交流、植物的生長與發育等具有重要的意義。同時蠟質在植物自身適應逆境及其生物非生物脅迫中也扮演著極其重要的角色。植物在長期適應逆境脅迫的過程中，通過自身代謝，會產生生理或形態的變化來避開逆境所造成的傷害。眾所周知，減少或阻止非氣孔性水分的散失是角質層最初的生理作用。角質層的保水功能是不容忽視的，當把角質層蠟質從角質層膜上去除后，角質層膜的水分滲透率會顯著性改變。Mohammadian等[17]有選擇性的從植物Leucadendron lanigerum的離體葉片中剝離了上表皮蠟質，從而導致其蒸騰速率顯著升高，表明表皮蠟質層是蒸騰失水的天然屏障。特別是在干旱少雨的條件下，植物在其表皮積累更多的蠟質進而減少非氣孔性水分的散失來抵御干旱脅迫。本研究中，筆者用氯仿浸提法提取了長柄扁桃和蒙古扁桃的表皮蠟質，并且粗略的進行了測定，結果表明，當長柄扁桃和蒙古扁桃遭受到不同程度的干旱脅迫后，其蠟質總量發生了變化，其變化規律是：總蠟質含量隨著干旱脅迫的加深呈現出先穩定不變后顯著升高的規律，當中度脅迫后，蠟質總量達到最大值。綜合上面所述，蒙古扁桃比長柄扁桃更具有抗干旱脅迫和耐瘠薄的能力，因此在沙漠地帶可以優先推廣種植。