利用同源重組構建Chordin、BMP6 真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究

榮 恒，李 晶，柳 楠，張夢瑤，賀建寧*

（1.青島農業大學動物科技學院，山東青島 266109；2.曲阜市畜牧獸醫技術服務中心，山東濟寧 273100）

隨著人們生活水平的提高，人們對羊毛的需求量不斷增加，對羊毛產量、質量的研究顯得尤為重要[1]。羊毛是毛囊的衍生物，羊毛產量和質量取決于毛囊的性質和結構[2]。與要控制羊毛的性狀發育特征，更取決于對毛囊發育規律和結構特征的研究[3]。敖漢細毛羊作為我國極具代表性的細毛羊品種之一[4]，大多數關于敖漢細毛羊羊毛的研究都集中在分子水平上探究羊毛性狀形成的機理[5]和羊毛的生長部位[6]，而在細胞水平上探索毛囊生長相關的基因也非常重要。

Chordin在腹原軸形成和原腸胚形成期間誘導神經組織，也在維持和分化中起主要作用[7]。據報道，Chordin是細胞外BMP 拮抗劑，以其高親和力與BMP-2/4 結合，進一步干擾與BMP 受體的結合[8]。Chordin作為BMPs 的分泌拮抗劑，在細胞外空間中對BMPs 的功能進行調節。Chordin基因與BMP 基因家族結合并阻止Chordin與其受體相互作用進而影響BMPs 的表達傳遞[9]。BMPs 作為毛囊發育的抑制信號分子[10]，Chordin可阻止其傳導途徑，間接體現出對毛囊發育的促進作用。

目前，關于Chordin和BMP6基因對細毛羊毛囊的影響基本明確，但只是基于分子層面，且Chordin和BMP6基因的相互作用尚未清晰。因此，本實驗通過將Chordin、BMP6質粒共轉染成纖維細胞后在細胞水平上驗證兩基因間的相互作用，為進一步的分子育種工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取40 日齡的健康胎羊（由青島奧特種羊場提供）并及時消毒處理。

TRIZol（Roche）試劑、蛋白裂解液、EcoRI 限制性內切酶、KpnI 限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、pcDNA3.1 質粒、DH5α感受態細胞、DMEM（基礎培養基）、胰蛋白酶、標準胎牛血清、DPBS（磷酸緩沖鹽溶液）、Lipofectamine 2 000、反轉錄試劑盒、SoSo試劑盒、切膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、培養皿等均購自青島尚賽科貿有限公司[11]。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 從組織中提取RNA 并反轉錄成cDNA。在綿羊Chordin和BMP6基因序列（GenBank登錄號分別為XM-027957560.1 和XM_027958445.1）CDS 區外側通過Primer5.0 設計引物，并在上游引物和下游引物的5'加入同源臂。Chordin基因完成后的引物序列上游引物：5'-TTTAAACTTAAGCTCGGAATTC CCCCAGCTGTCCCGTTCG-3'；下游引物：5'-TGGATC CGAGCTCGGCTAGGAGCCTTCATCTTCTTTCCCAG AC-3'。BMP6基因完成后的引物序列上游引物：5'-TT TAAACTTAAGCTTGGTACCATGATTCCTGGTAACC GAATGCTG-3'；下游引物：5'-TGGATCCGAGCTCGG TACCTCAGCGGCACCCACATCCCTCCACTA-3′。

通過PCR 擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，體系均為25 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，金牌Mix 22 μL。

1.2.2Chordin、BMP6基因與pcDNA3.1 質粒同源重組對pcDNA3.1 質粒進行EcoRI、KpnI 單酶切，酶切體系：EcoRI 1 μL，KpnI 1 μL；pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，補水至50 μL；置于37℃金屬浴中2 h。電泳檢測后，通過切膠回收試劑盒純化Chordin、BMP6基因及切開的pcDNA3.1，通過T4DNA 連接酶將Chordin、BMP6基因與pcDNA3.1 分別進行連接，體系：Chordin、BMP6基因各1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL；置于50℃金屬浴10 min。之后轉至DH5α感受態細胞，選取搖菌后的單菌落對其進行陽性率測定，經測序、質粒提取最終獲得陽性質粒[11]。

1.2.3 成纖維細胞的培養 用75%酒精浸洗2 遍從羊場取回的40 日齡胎羊成之后，在培養皿中用75%酒精再次清洗3 遍，最后用含有雙抗的PBS 反復清洗3 遍。之后用剪刀剪掉頭部和四肢，然后將軀干剪成1.5 mm3左右，將其放在培養皿，加胎牛血清，在細胞培養箱CO2為5%、溫度37℃的培養箱中培養4 h，再加培養液。從培養箱拿出24 h 后，用PBS 沖洗干凈，更換培養液，定時觀察。細胞生長到95%左右進行傳代培養[11]。

1.2.4 細胞轉染 在傳代后2 代進行轉染。用Lipofecta mine 2 000 進行瞬時轉染，單、共轉染組分別加20 μL脂質體試劑和480 μL DMEM（不含雙抗），混勻，靜置10 min。在共轉染組中加入20 μL 構建好的表達載體和460 μL DMEM，對照組加入20 μL 構建好的表達載體和480 μL DMEM，靜置20 min，然后將實驗組和對照組都移到培養皿中均加入4 mL DMEM，在37℃條件下，培養6 h 后換液，培養36 h[11]。

1.2.5 細胞轉染后的RT-PCR 擴大培養轉染成功的單細胞 細胞在培養皿底部長到95%時，每個板加TRIZol（Roche）試劑3 mL，細胞裂解后進行RNA 提取。RNA提取完成后，測定濃度和純度符合標準后將其反轉錄成cDNA[17]。通過PrimerPremier5.0 軟件設計Chordin、BMP6和GAPDH基因的引物序列（表1）。

表1 引物信息

通過實時熒光定量PCR 反應測定表達量，實驗組和對照組各3 次重復，Chordin相對于內參基因GAPDH的表達量用Ct（2-ΔΔCt）值法計算。利用SPSS 17.0 中t檢驗進行數據分析[12]。

1.2.6 細胞轉染后Western Blot 檢測蛋白表達 利用蛋白質印跡法（Western Blotting）將樣品分為實驗組和對照組，每個組3 個生物學重復。先裂解提取細胞中的蛋白質，內參基因GAPDH、單轉染、共轉染組分別點3 個膠孔，電泳后對蛋白質進行PVDF 轉膜，用轉膜電泳槽進行2～3 h，之后封閉蛋白質2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；以1:2 000 的比例對一抗進行稀釋，在4℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3 次,每次5 min。以1:2 000 的比例稀釋二抗，孵育1.5 h；在暗室中曝光。用ImageJ 軟件分析條帶，結果用SPSS17.0 統計分析軟件進行分析[12]。

2 結果

2.1 目的基因擴增 圖1 為凝膠電泳分析結果（2% 瓊脂糖凝膠），擴增條帶分別位于2 874 bp 和537 bp 處，分別為Chordin和BMP6基因，與已知一致。

2.2 pcDNA3.1 載體單酶切及純化 利用EcoRI、KpnI酶對pcDNA3.1 單酶切，EcoRI、KpnI 酶切效果良好，pcDNA3.1 載體5 428 bp，可用于后期的實驗（圖2）。

2.3 表達載體pcDNA3.1 與目的片段重組及鑒定 通過膠回收獲得純凈Chordin、BMP6基因片段和pcDNA3.1，利用SoSo 試劑盒分別將其連接。之后轉化至大腸桿菌DH5α中，37℃過夜振蕩培養。對菌液進行PCR 電泳鑒定結果顯示（圖3），在2 874 bp 和537 bp 處各有單一明亮條帶，為Chordin、BMP6基因。菌液測序后用BLAST 比對，堿基均未發生突變，可用于后續實驗。提取重組質粒，如圖4 所示，pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-Choedin 重組后質粒大小分別為5 965、8 302 bp，表明重組質粒構建成功。

2.4 細胞培養 每天定時用電子倒置顯微鏡觀察成纖維細胞的生長情況，記錄成纖維細胞原代培養的形狀變化（圖5）。24 h 后細胞逐漸貼壁，并有些許細胞從組織塊中游離出來，其呈梭形、圓形。待密度達到90%進行傳代培養。傳代后細胞仍為梭形。

2.5 實時熒光定量PCR 檢測mRNA 的表達 從轉染后的成纖維細胞中提取RNA，之后反轉錄成cDNA，以其為模板，利用上、下游引物對目的基因Chordin、BMP6和內參基因GAPDH片段同時進行PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖6）表明，擴增的條帶單一明亮，GAPDH產物大小為125 bp、Chordin產物大小為127 bp、BMP6產物大小為112 bp，與已知大小均相同，可繼續實時熒光定量PCR 實驗。

目的基因Chordin、BMP6和內參基因GAPDH的擴增曲線、熔解曲線如圖7 所示，曲線清晰且只有1 個峰值，表明在實時熒光定量PCR 過程中無二聚體且得到了特異性的擴增產物，可用來進行定量分析。利用SPSS 對兩組mRNA 的表達量進行測定和分析，經共轉染成纖維細胞后，Chordin基因的表達量極顯著提高，BMP6基因的表達量顯著降低（圖8）。

2.6 Westren Blot 檢測蛋白的表達 以成纖維細胞提取的蛋白為模板進行Western Blot。如圖9 顯示，共轉染組的條帶明顯粗于單轉染的對照組，由Image J 軟件分析灰度值，灰度值用SPSS 分析。由圖10 可知，共轉染組Chordin基因蛋白的表達高于單轉染組（P＜0.01），共轉染組BMP6基因蛋白的表達低于單轉染組（P＜0.01）。

3 討 論

許多研究表明，毛囊的發育依靠一系列的信號分子，這些信號分子在真皮細胞和上皮細胞間穿梭著，介導了這2 個細胞群體間的相互作用，從而促使毛囊的形成[13]。目前，調節毛囊形態發生的信號分子主要分為Wnt 通路、TNF 家族、FGF 家族、BMP 家族、Shh 通路、TGF 家族和NOTCH 通路七類[14]。這些信號分子之間都會相互作用調控，有的是毛囊發育的促進物，有的是抑制物。BMP6屬于BMP 家族中的一員，此家族中的基因基本上都抑制毛囊的發育。Meephansan 等[15]研究表明，BMP4基因在絨山羊毛囊生長發育的退行期表達量最高，隨著進入生長期其表達量逐漸降低，其表達量隨著毛囊的周期性變化而變化。Botchkarev 等[16]于2001 年發現Noggin基因可以間接促進毛囊生長，其作用機制抑制了BMP4基因的活性。Chordin基因也可作為BMPs 類的拮抗劑。有研究表明，Chordin基因在背軸形成中起到了重要的作用，是背軸形成的組件之一。來自組織的Chordin分泌作為骨形態發生蛋白（BMP）的拮抗劑，從而調節其在爪蟾中的活性。Chordin在背側保持低BMP 活性水平，誘導背部組織形成，如神經外胚層。

之前的研究表明，Chordin對毛囊的發育起到了一定促進作用，而BMP6基因對毛囊的發育起到了一定的抑制作用。但2 個基因間的作用機制還尚未清晰。因此，通過本實驗將BMP6基因和Chordin的過表達載體單、共轉染至成纖維細胞后測定其表達量的變化。

4 結 論

本研究通過對pcDNA3.1-Chordin、pcDNA3.1-BMP6載體的構建，利用實時熒光定量PCR、Western Blot 技術檢測其轉染成纖維細胞后的表達量，證實共轉染成纖維細胞后Chordin基因的表達量明顯升高且共轉染組的表達量極顯著高于單轉染組，BMP6基因的表達量明顯下降，且共轉染組的表達量極顯著低于單轉染組，Chordin基因抑制了BMP6基因的表達，BMP6基因促進了Chordin基因的表達，進而確定2 個基因間的作用關系。本實驗可作為之前研究作補充，為進一步的分子育種工作提供依據。