干酪乳桿菌16發酵豆乳工藝優化及抗氧化性研究

侯凱榮 妥彥峰 牟光慶

(大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034)

豆乳中含有豐富的營養物質，如大豆蛋白及不飽和脂肪酸等，對人體健康有益[1]。利用乳酸菌發酵豆乳，可將大豆中的異黃酮、蛋白質等物質進行適當生物轉化，更利于人體吸收，具有增加免疫力、抗氧化等作用[2-3]。

唐宇等[4]研究發現干酪乳桿菌16發酵豆乳具有一定的抗氧化功能，主要是由于糖苷型大豆異黃酮轉變為苷元型大豆異黃酮導致其抗氧化能力發生改變。徐寅等[5]發現發酵后豆乳的抗氧化能力較發酵前增強。Dajanta等[6]對發酵豆類進行研究發現，總酚含量與其抗氧化能力相關。孫曉琦等[7]發現乳桿菌發酵黃漿水可顯著提高其抗氧化能力，且與總酚含量呈正相關。李彤等[8]采用植物乳桿菌發酵復合豆乳時，其游離氨基酸含量上升，且總抗氧化能力較發酵前有所增加。

在前期研究基礎上，試驗擬以總酚、游離氨基酸含量為指標，對L.casei16發酵豆乳工藝條件進行優化，并測定優化后發酵豆乳的總還原力和羥自由基清除能力，旨在為深入開發具有良好抗氧化功能特性的發酵豆乳提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

大豆：市售；

沒食子酸、鄰苯二甲醛、鄰二氮菲：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

MRS培養基：生物試劑，青島高科園海博生物技術有限公司；

硫酸亞鐵、三氯化鐵：分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；

β-巰基乙醇、三氯乙酸、四硼酸鈉、丙酮、過氧化氫、鐵氰化鉀：分析純，天津市大茂化學廠；

福林酚：分子生物學級，大連美侖生物有限公司。

1.1.2 儀器與設備

物性儀：TA-XT plus型，英國超技公司；

全自動家用豆漿機：DJ11B型，九陽股份有限公司；

生化培養箱：FQC型，上海一恒科學儀器有限公司；

超凈工作臺：SWCJ1D2D型，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；

酶標儀：1510型，美國Thermo Fisher Scientific 公司；

精密pH計：S210型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

離心機：5804型，德國艾本德有限公司。

1.1.3 試驗菌株

L.casei16：保藏號CCTCC M2018557，大連工業大學食品學院大連益生菌功能特性研究重點實驗室提供，保藏于中國典型培養物保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

大豆→浸泡→磨漿→冷卻→接菌→發酵→冷藏→取樣→測定

1.2.2 操作要點

(1) 室溫下，按干豆與水重量比為1∶2泡發黃豆12 h，按干豆與水重量比為1∶4進行制漿，采用雙層濾布對豆漿進行過濾，于高壓蒸汽滅菌鍋中105 ℃滅菌15 min。

(2) 菌種活化采用MRS液體培養基，以2%接種量將L.casei16連續活化3代(37 ℃，18 h)用于豆漿發酵。

1.2.3 單因素試驗

(1) 發酵時間對發酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響：豆乳滅菌處理后冷卻至室溫，以2%接種量接種L.casei16，37 ℃培養箱中分別發酵6，12，24 h，4 ℃條件下冷藏6 h。

(2) 冷藏時間對發酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響：豆乳滅菌處理后冷卻至室溫，以2%接種量接種L.casei16，37 ℃培養箱中發酵24 h，4 ℃條件下分別冷藏6，12，24 h。

(3) 發酵溫度對發酵豆乳總酚、游離氨基酸含量的影響：豆乳滅菌處理后冷卻至室溫，以2%接種量接種L.casei16，分別于37，40，43 ℃培養箱中發酵24 h，4 ℃ 條件下冷藏6 h。

1.2.4 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上，以發酵溫度、發酵時間、冷藏時間為試驗因素，以總酚和游離氨基酸含量為評價標準，采用L9(33)正交試驗進行L.casei16發酵豆乳工藝條件優化。

1.2.5 物性指標檢測 參照華曉曼等[9]的方法略作修改，利用物性儀進行硬度、稠度、內聚性、黏度指數測定。探頭A/BE、測試速度1.00 mm/s、返回高度30.00 mm、測試距離15.00 mm、觸發力5.00 g。

1.2.6 pH測定 采用pH計法。

1.2.7 總酚含量測定 參照王振帥等[10]的方法略作修改，取10 g發酵豆乳，加入10 mL 50% 丙酮，40 ℃振蕩4 h，調節pH至4.5，1 500 r/min離心10 min，取上清液100 μL稀釋至1 mL，分別加入福林酚0.5 mL，搖勻，加入12% Na2CO3溶液1 mL，用水稀釋至12.5 mL，搖勻，避光反應2 h，測定765 nm處吸光值，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=5.105 1x+0.009 7，R2=0.996 9。

1.2.8 游離氨基酸測定 參照Xing等[11]的方法略作修改，取10 g發酵豆乳于50 mL離心管中，調節pH至4.5，靜置20 min，4 ℃、3 000 r/min離心30 min。取50 μL上清液加入1 mL鄰苯二甲醛試劑，室溫反應2 min，測定340 nm處吸光度，以亮氨酸為標準物繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=1.294 7x+0.007 7，R2=0.996 8。

1.2.9 抗氧化活性測定

(1) 總還原能力：參照文獻[12]。

(2) 羥自由基清除能力：參照文獻[13]。

1.3 數據處理

所有試驗均為3次重復，采用SPSS 2.0軟件對試驗數據進行統計分析，并采用Orgin 9.0軟件繪圖，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間對發酵豆乳質構、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表1可知，物性指標均隨發酵時間的延長而升高；pH值隨發酵時間的延長而顯著下降(P<0.05)。pH值的降低會導致發酵豆乳中的大豆球蛋白聚集凝結[2]，使分子間作用力不斷加強，黏度、硬度增加[14]。隨著發酵時間的延長，發酵豆乳中總酚、游離氨基酸含量均發生顯著變化(P<0.05)，當發酵時間為24 h時，發酵豆乳中總酚、游離氨基酸含量達最大值，分別為15.56 mg/100 mL 和1.41 mg/mL。這是由于隨著發酵時間的延長，發酵豆乳中蛋白質被L.casei16產生的酶逐漸水解，因此游離氨基酸含量較發酵前升高[15]。而且L.casei16將豆乳中復雜的大分子酚類物質轉化為小分子酚類物質，釋放出更多的酚羥基，故總酚含量較發酵前有所增加，與張琪等[16]的結果一致。

表1 不同發酵時間下發酵豆乳的性能指標

2.1.2 冷藏時間對發酵豆乳質構、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表2可知，發酵豆乳冷藏12 h與冷藏24 h的硬度無顯著性差異；當冷藏時間為24 h時，發酵豆乳的稠度、內聚性和黏度指數均顯著高于(P<0.05)其他冷藏條件下的。發酵豆乳的pH值隨冷藏時間的延長無顯著性變化，這是由于低溫條件下，發酵豆乳中L.casei16生長速度降低，乳酸生成速度降低，發酵豆乳pH值呈相對穩定的狀態[2]。當冷藏時間為12 h時，發酵豆乳中總酚含量最高，為14.53 mg/100 mL，與耿彪等[17]的結論一致。后期發酵豆乳中總酚含量下降可能是由于發酵豆乳中總酚發生氧化所致[18]。發酵豆乳中游離氨基酸含量隨冷藏時間的延長先降低后升高，可能是冷藏12 h后，發酵豆乳中發生了其他化學變化，從而使游離氨基酸含量升高[19]。

表2 不同冷藏時間下發酵豆乳的性能指標

表3 不同發酵溫度下發酵豆乳的性能指標

2.1.3 發酵溫度對發酵豆乳質構、pH、總酚和游離氨基酸含量的影響 由表3可知，當發酵溫度為37 ℃時，發酵豆乳硬度、稠度、黏度指數均達最高值。當發酵溫度為30，37 ℃ 時，發酵豆乳pH值較低，發酵豆乳中的大豆球蛋白不斷聚集凝結，進而導致硬度、稠度、內聚性、黏度指數發生變化，可能是此時發酵豆乳中L.casei16生長狀態良好[2]，產酸能力較強，導致pH值較低。當發酵溫度為43 ℃時，發酵豆乳中L.casei16的生長、產酸能力下降，體系中pH偏高。

由表3還可知，當發酵溫度為43 ℃時，發酵豆乳中總酚含量顯著增高(P<0.05)，可能是由于發酵溫度的升高導致發酵豆乳中分子滲透、擴散、溶解速度加快，并且高溫條件可以弱化或破壞細胞壁的完整性，使酚類物質更容易從發酵豆乳中轉移至溶劑中，二者共同作用下導致了發酵豆乳中總酚含量的增加[20]；發酵豆乳中游離氨基酸含量隨發酵溫度的升高而顯著升高。發酵過程中，Lactobacillus主要是由胞內肽酶(乳內肽酶、氨基肽酶等)降解寡肽從而產生游離氨基酸[21]。當發酵溫度為43 ℃ 時，發酵豆乳中游離氨基酸含量最高，為1.04 mg/mL。劉璐[22]研究發現，鼠李糖乳桿菌1.0386的胞壁蛋白酶、氨肽酶的最適溫度分別為40，45 ℃。推測發酵溫度為43 ℃下游離氨基酸含量升高的原因可能是L.casei16發酵所產生的酶在43 ℃時保持良好活性。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以總酚、游離氨基酸含量為考察指標，對發酵時間、冷藏時間、發酵溫度進行正交試驗以確定最優的發酵條件。試驗因素水平見表4，結果與分析見表5。

表4 因素水平表

由表5可知，總酚含量的最優方案為A3B1C2，即發酵溫度37 ℃，發酵時間24 h，冷藏時間6 h。游離氨基酸含量的最優方案為A3B3C2，即發酵溫度37 ℃，發酵24 h，冷藏24 h。由表6可知，各因素對總酚、游離氨基酸含量的影響不顯著(P>0.05)。

綜合考慮上述兩個正交試驗結果的差異，如表7所示，方案A3B3C2的總酚含量高于方案A3B1C2，但差異不顯著(P>0.05)，結合實際生產需求，確定最佳的發酵條件為A3B1C2，即發酵時間24 h，冷藏時間6 h，發酵溫度37 ℃，此條件下發酵豆乳的總酚含量為13.94 mg/100 mL，游離氨基酸含量為1.33 mg/mL。陳佩等[2]發現，經24 h發酵后，L.caseiCCFM0412發酵豆乳中游離氨基酸含量上升，但低于試驗結果，說明通過試驗條件優化后，提高了發酵豆乳中游離氨基酸含量。

表5 正交試驗結果及分析

表6 正交試驗方差分析

表7 發酵豆乳優化方案驗證實驗

2.3 抗氧化能力比較

由表8可知，與未發酵豆乳相比，采用L.casei16發酵的未優化組和優化組豆乳總還原力分別為0.28，0.31，羥自由基清除能力分別為72.35%，79.43%，顯著高于未發酵豆乳的(P<0.05)；優化后的發酵豆乳總還原能力和羥自由基清除能力得到顯著提高(P<0.05)。Suo等[23]發現發酵乳桿菌Zhao發酵豆乳的羥自由基清除能力為55.1%，保加利亞乳桿菌發酵豆乳羥自由基清除能力為31.7%，均低于試驗結果。

表8 抗氧化能力比較

3 結論

試驗表明，發酵豆乳的最優工藝條件為L.casei16以2%接種量接種于豆乳，37 ℃發酵24 h，4 ℃冷藏6 h；該條件下發酵豆乳的總酚含量為13.94 mg/100 mL，游離氨基酸含量為1.33 mg/mL；優化條件下發酵豆乳的總還原能力為0.31，羥自由基清除能力為79.43%。后續將對L.casei16發酵豆乳的抗氧化機制進行研究。