光譜法和分子對接研究3種獸醫臨床常用抗菌藥對脲酶的影響及作用機制

王玨,徐佳迎,程粟裕,趙鴿,蔣靜艷

(南京農業大學資源與環境科學學院,江蘇 南京 210095)

抗菌藥是細菌、真菌等微生物所產生的或者人工化學合成的一類具有抗病原體和其他活性的物質,可用于人和動物細菌感染性疾病的預防和治療,被廣泛用于動物飼料中,是目前世界上使用范圍最廣、使用量最大的一類藥物[1]。有些抗菌藥不能被有機體完全吸收,大部分以母體化合物的形式隨畜禽糞便排出體外[2]。已有研究表明磺胺類和四環素糞尿排出物隨污水處理廠污泥、有機肥施用、污水灌溉、魚類底泥施用等途徑進入水體或土壤環境中,對水體或土壤中的生物產生直接或間接毒害作用,并且誘導抗性細菌及抗性基因出現,從而導致特殊的生態毒理效應,最終進入食物鏈威脅人類健康[3]。

脲酶(urease,EC3.1.1.5)廣泛存在于各種細菌、真菌、動物、植物和人體中,能快速催化尿素水解為氨和二氧化碳,脲酶的活性直接影響尿素的利用率,有脲酶催化情況下,尿素的水解速率是無催化反應速率的1014倍[4]。環境中污染物的攝入可能改變脲酶的結構,從而引起其功能和特性的改變,進而影響尿素的利用率。國彬等[5]通過室內土壤培養試驗結果表明,培養前期磺胺類抗菌藥對脲酶活性的影響表現為“低促高抑”,培養后期呈現一定的抑制作用。閆賽紅[6]研究表明典型喹諾酮類抗菌藥恩諾沙星對土壤脲酶活性的影響表現高濃度有顯著抑制作用。金蘭淑等[7]研究表明,四環素的加入對土壤脲酶活性的影響為低濃度促進,高濃度抑制,不同濃度四環素對酶活性的影響不一樣。關于外源物質如何作用于脲酶、作用力是什么、作用位點在哪里,這些問題尚不清楚。

光譜法具有分析速度快、操作簡便、靈敏度高等特點,是研究小分子與蛋白質之間相互作用的最為典型的方法之一[8]。目前常用的方法有熒光光譜法、紫外-可見吸收光譜法、圓二色光譜法等。分子對接法是一種分子模擬技術,依據配體與受體作用的“鎖-鑰原理”,將小分子配體置于受體的活性位點處,通過理論計算得到配體和受體相互作用的最佳匹配,以達到模擬小分子和生物大分子相互作用的目的[9]。Bagheri等[10]運用光譜法和分子對接法研究表明,黃曲霉素B1和G1以氫鍵和疏水力為主要作用力與人血清蛋白(HSA)相互結合,導致HSA熒光光譜發生猝滅,且G1與HSA的結合能力高于B1。Zeng等[11]運用多種光譜法結合分子對接研究表明,蘆薈大黃素通過靜電作用與酪氨酸酶在其活性部位形成1個結合位點,引起酪氨酸酶構象改變,同時占據酶的催化中心,避免底物進入,導致酪氨酸酶活性降低。目前,關于獸用抗菌藥與脲酶相互作用的機制尚未明確。

本文選擇了磺胺類、四環素類、喹諾酮類三類抗菌藥的典型代表磺胺二甲嘧啶(SMZ,EC200-346-4)、恩諾沙星(ENR,EC618-911-2)和四環素(TC,EC200-481-9)及脲酶為研究對象,測定水溶液中3種抗菌藥對脲酶活性的影響,運用熒光光譜法結合紫外-可見吸收光譜法探究其與脲酶相互作用的參數信息和構象變化,通過分子對接預測二者的最佳結合位點和作用力信息,研究一些抗菌藥對脲酶活性的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脲酶(精制級)和鹽酸四環素(USP級)購自上海源葉生物科技有限公司,磺胺二甲嘧啶鈉(純度:98%)和恩諾沙星(純度:98%)購自上海麥克林生化科技有限公司,其結構式如圖1所示。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)濃度為0.05 mol·L-1,pH7.0。用超純水將脲酶配制成1 mg·mL-1的儲備液;準確稱取適量SMZ、TC標準品,配制成2.0×103μmol·L-1的儲備液,ENR儲備液濃度為4.0×103μmol·L-1;準確稱取適量尿素,配制成4 mol·L-1的儲備液。試驗用水為超純水(≥18.25 MΩ·cm),其他試劑均為分析純。

UV-1601紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);Ensight多功能成像酶標儀(美國Perkin Elmer公司);759S紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性[12]。取10 mL容量瓶,加入不同體積(SMZ、TC:0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 mL;ENR:0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.750、1.000、1.500和2.000 mL)抗菌藥儲備液和0.65 mL 脲酶儲備液,10 ℃下充分混合反應1 h后,作為酶液備用,酶液中加入2 mL尿素儲備液和4 mL PBS緩沖液,超純水定容,室溫下反應20 min后,作為工作液備用。移取工作液10 μL于50 mL容量瓶中,加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液,邊加邊搖勻,20 min 后顯色,定容,1 h內在分光光度計于578 nm波長處比色。預試驗結果證明,SMZ和TC濃度為 400 μmol·L-1時,脲酶活性變化趨勢基本保持平穩,而ENR呈增加趨勢,因此SMZ和TC濃度范圍設置為0～400 μmol·L-1,而ENR濃度范圍適當增加,設置為0～800 μmol·L-1。標準曲線繪制方法:取10 mL容量瓶,加入不同體積脲酶儲備液,10 ℃下放置1 h后,作為酶液備用,其他步驟同上。以脲酶濃度為橫坐標,A值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 熒光光譜法取一系列10 mL容量瓶,加入0.65 mL 脲酶儲備液(0.065 mg·mL-1)和不同體積(SMZ、TC:0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75和2.00 mL;ENR:0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.750、1.000、1.500和2.000 mL)抗菌藥儲備液,超純水定容,設置3組平行,在10 ℃ 下靜置1 h后,在激發波長為280 nm,于295～700 nm掃描混合體系?？咕帩舛确秶富钚詼y定。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜法準確量取0.65 mL 脲酶儲備液(0.065 mg·mL-1)和不同體積(SMZ、TC:0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mL;ENR:0、0.025、0.050、0.100、0.150、0.200、0.250和0.300 mL)抗菌藥溶液加入10 mL容量瓶中,超純水定容,設置3組平行,在10 ℃下靜置1 h后于紫外可見分光光度計上于190～500 nm掃描混合體系。預試驗證明SMZ、ENR、TC檢測上限為100～150 μmol·L-1,因此紫外-可見吸收光譜測定時,3種抗菌藥的濃度范圍設為0～120 μmol·L-1。

1.2.4 分子對接法脲酶晶體結構來自于RCSB蛋白質數據庫(https://www.rcsb.org/),編碼為3LA4。采用Gauss View 95.0軟件繪制配體(SMZ、TC、ENR)的三維結構,并用Gaussian09軟件通過DFT/B3LYP方法進行優化,得到其能量最小的構象。利用AutoDock 4.2.6軟件進行分子對接,通過拉馬克遺傳算法預測蛋白質分子和配體的最佳結合位置,選取結合能最低的復合物構象,利用PyMOL軟件進行可視化研究。

2 結果與分析

2.1 磺胺二甲嘧啶(SMZ)、恩諾沙星(ENR)、四環素(TC)對脲酶活性的影響

由圖2可知:SMZ和ENR對脲酶活性有一定的促進作用,而TC對脲酶活性呈低濃度促進、高濃度抑制作用。隨SMZ濃度逐漸增加,SMZ對脲酶活性促進作用逐漸增強。當SMZ濃度為400 μmol·L-1時,促進率達到37.20%;ENR濃度為0～800 μmol·L-1,其對脲酶活性的促進作用隨ENR濃度增加逐漸增強,且當ENR為800 μmol·L-1時,促進率達47.00%;TC在較低濃度(0～50 μmol·L-1)時對脲酶活性有促進作用,當濃度進一步增加,其對脲酶活性由促進作用轉為抑制作用,且當TC濃度為350 μmol·L-1時,抑制率達89.00%,之后基本穩定。當SMZ、ENR、TC在同一濃度水平時,TC對脲酶活性的影響程度明顯大于SMZ和ENR。除150和400 μmol·L-1之外,ENR對脲酶活性的影響程度均大于SMZ。

2.2 SMZ、ENR、TC對脲酶熒光光譜的影響

激發波長為280 nm時,脲酶的特征熒光峰在340 nm左右。由圖3可知:保持脲酶濃度不變,隨SMZ、ENR、TC濃度的增加,脲酶的熒光強度均呈有規律的降低,有明顯的猝滅作用。在SMZ的作用下,脲酶熒光強度逐漸降低且最大發射波長發生紅移;ENR的加入導致熒光強度逐漸降低,且隨ENR濃度增加,脲酶特征峰消失;在TC的作用下,脲酶熒光強度逐漸降低且最大發射波長發生輕微藍移。這初步表明3種抗菌藥SMZ、ENR、TC與脲酶發生了相互作用,導致脲酶熒光發生猝滅。

熒光猝滅的類型分為靜態猝滅和動態猝滅[9]。動態猝滅是激發態熒光分子與猝滅劑發生能量轉移或物理碰撞導致;靜態猝滅是小分子與蛋白質之間形成復合物導致。所得熒光數據利用Stern-Volmer方程進行分析[13]:F0/F=1+KSVQ=1+Kqτ0Q。式中:F0為脲酶在340 nm處的熒光強度;F為SMZ-脲酶、ENR-脲酶、TC-脲酶混合體系在340 nm處的熒光強度;Q為猝滅劑的濃度;KSV為Stern-Volmer猝滅常數;Kq為猝滅速率常數;τ0為猝滅劑不存在時熒光分子平均壽命(生物大分子的平均壽命約為10-8s);各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數為2.0×1010L·mol-1·s-1。以F0/F對Q作圖,由直線斜率得到Stern-Volmer猝滅常數KSV,由此計算出相應的猝滅速率常數Kq,數據見表1。在一定濃度范圍內,3種抗菌藥SMZ、ENR、TC的猝滅速率常數Kq均遠大于2.0×1010L·mol-1·s-1,因此推測脲酶的熒光猝滅是由于SMZ、TC、ENR與脲酶形成復合物引起的靜態猝滅。

采用位點結合模型描述天然產物分子與蛋白之間的相互作用。對于靜態猝滅過程,蛋白質熒光強度與猝滅劑濃度的關系滿足Lineweaver-Burk雙對數方程:lg[(F0-F)/F]=lgK+nlgQ[13],以lg[(F0-F)/F]對lgQ作圖,可根據斜率和截距得到結合常數和結合點數,結果見表2。SMZ、ENR、TC與脲酶的結合常數分別為1.10×104、6.20×103和1.74×106,結合位點數分別為1.06、0.82和1.43,均約等于1,表明 3種抗菌藥均能與脲酶形成1∶1的復合物,其中TC的結合作用較強。

表2 SMZ-脲酶、ENR-脲酶和TC-脲酶相互作用的結合常數(KA)和結合位點數(n)Table 2 Binding constants(KA)and binding sites(n)of the SMZ-urease,ENR-urease and TC-urease interactions

2.3 SMZ、ENR、TC對脲酶紫外-可見吸收光譜的影響

蛋白質在200 nm處的吸收峰是肽骨架本身電子位移的躍遷,而280 nm處的吸收峰則是蛋白質殘基的特征吸收峰[14]。為進一步研究脲酶的構象變化,分別測定不同濃度SMZ、ENR、TC與脲酶反應體系的紫外吸收光譜圖(圖4)。未添加抗菌藥時,脲酶在202和278 nm處各有1個吸收峰,分別表示脲酶蛋白質骨架的光譜性質和氨基酸殘基的特征吸收。隨SMZ、ENR、TC的加入,202 nm處的吸收峰隨濃度的增加逐漸增強,并發生輕微紅移,表明SMZ、ENR、TC均與脲酶發生相互作用,導致脲酶蛋白質骨架更加緊密。隨SMZ的加入,278 nm處的吸收峰藍移至260 nm,并且吸收峰強度隨SMZ濃度增加而逐漸增強。當SMZ濃度為80 μmol·L-1時,SMZ在240 nm處也有吸收峰產生,并隨SMZ濃度增加而增強;隨ENR濃度的增加,278 nm處的吸收峰藍移至271 nm,且吸收峰強度逐漸增強,表明脲酶氨基酸殘基周圍環境發生改變;隨TC濃度的增加,278 nm處的吸收峰逐漸增強,并發生輕微藍移,TC在360 nm處也有1個吸收峰,且隨TC濃度的增加而增強。

2.4 SMZ、ENR、TC與脲酶的分子對接

脲酶未發生分子對接時,其自身活性中心有2個Ni原子,Ni(1)與HIS-519(組氨酸)和HIS-545(組氨酸)配位,Ni(2)與ASP-633(天冬氨酸)、HIS-409(組氨酸)、HIS-407(組氨酸)和KCX-490(羧化賴氨酸)配位,脲酶的催化尿素水解活性主要靠其活性部分的Ni(2)離子發揮作用[15]。由圖5可知:SMZ、ENR、TC與脲酶發生結合作用時,脲酶活性中心與Ni配位的氨基酸殘基未發生改變,且3種抗菌藥均與脲酶產生氫鍵,表明氫鍵是重要的結合方式。SMZ分別與ARG-439(精氨酸)和VAL-591(纈氨酸)形成2個氫鍵,鍵長分別為2.5和2.4 nm;ENR與ARG-439(精氨酸)形成2個氫鍵,鍵長分別為1.9和2.6 nm,與CYS-592(半胱氨酸,標記為CME-592)形成1個氫鍵,鍵長為3.3 nm;TC與ASP-494(天冬氨酸)形成2個氫鍵,鍵長分別為2.2和2.9 nm。

由表3可知:除氫鍵作用力以外,還有范德華力、去溶劑能和靜電作用力發揮作用。3種抗菌藥與脲酶最優結合構象的結合能從大到小依次為:SMZ、ENR、TC,即隨苯環數目的增加,其與脲酶結合更緊密,結合生成的復合物也更穩定。

表3 SMZ-脲酶、ENR-脲酶和TC-脲酶結合的對接參數信息Table 3 The docking parameter information results of SMZ-urease,ENR-urease and TC-urease binding

3 討論

酶蛋白具有多樣和復雜的結構,這些結構與其功能存在一定關系,其結構的改變可能會引起相關功能的改變[16]。在本試驗濃度范圍內,SMZ和ENR對脲酶活性有促進作用,TC表現為低濃度促進,高濃度抑制作用,與文獻的研究結果[5-7]不同。已有研究多為稻田栽培試驗和室內土壤培養試驗,且受培養時間影響,其中抗菌藥對土壤脲酶活性影響可能與土壤固氮和有機質含量顯著相關[17],并且可能是抗菌藥母體與降解產物共同作用的結果。本試驗為純抗菌藥試劑與脲酶的短時間反應,試驗結果僅反映抗菌藥母體對脲酶活性與結構的影響。

外源分子與脲酶相互作用可能引起脲酶熒光強度的變化,包括激發態反應、分子重排、能量轉移和基態配合物的形成[18]。本研究中,熒光光譜結果表明,SMZ、ENR、TC均與脲酶結合形成1∶1的復合物,導致熒光發生猝滅,其中SMZ導致脲酶熒光光譜發生輕微紅移,TC導致輕微藍移。張晟瑞等[19]研究表明SMZ改變了疏水性氨基酸殘基Trp(色氨酸)附近的微環境,使其疏水性減少,從而猝滅了人血清蛋白(HSA)的熒光且發生輕微紅移。本研究中SMZ的結果與此結果一致,SMZ的加入導致Trp殘基微環境極性增加,疏水性降低。Hao等[20]運用光譜法研究姜黃素(CUR)與牛血清蛋白(BSA)的相互作用結果表明,CUR與BSA結合形成1∶1復合物,且CUR改變了Trp殘基附近的微環境,使其疏水性增加,導致BSA熒光光譜發生猝滅且輕微藍移。本研究中TC的結果與此結果一致,表明TC的加入導致Trp殘基微環境極性降低,疏水性增加。

分子對接法進一步驗證,SMZ、ENR、TC均與脲酶產生氫鍵,其中與SMZ結合的ARG-439和與ENR結合的ARG-439、CME-592均為親水性氨基酸,導致脲酶活性中心親水性增強,疏水性降低,從而促進底物進入脲酶活性中心,表現為促進脲酶活性。Ali等[21]研究表明,疏水性氨基酸的作用抑制6-甲酰傘形酮膽堿酯酶活性,與本試驗結果一致。與TC結合的ASP-494為親水性氨基酸,導致脲酶表面親水性增強,推測在低濃度時親水性氨基酸的作用表現為促進脲酶活性。此外,空間阻位作用也會影響底物和酶的親和力,空間阻位作用大于氨基酸殘基,導致疏水性增加,熒光光譜表現為輕微藍移。李興春等[22]等研究表明,體積較大的基團與周圍氨基酸殘基間存在空間阻位。Gao[23]等通過分子對接表明TCH(鹽酸四環素)對半乳糖苷酶的抑制作用,可能是由于TCH插入酶活性中心產生空間阻位。本研究中,TC在脲酶活性中心的結合位置與SMZ、ENR不同,推測由于TC體積比SMZ和ENR大,隨TC濃度的升高,產生空間阻位,從而抑制底物與脲酶結合。這種抑制作用可能在TC濃度夠高且空間阻位作用大于親水性作用時才表現出來,因此低濃度TC由于氨基酸殘基微環境的改變表現為促進脲酶活性。

SMZ、ENR、TC對脲酶活性的影響程度從大到小依次為TC、ENR、SMZ,即影響程度隨苯環數的增加而增大,且分子對接進一步表明SMZ、ENR、TC與脲酶的結合作用隨苯環及苯環上羥基數目的增多而增強。苯環數量導致結合作用增強的原因尚不明確,還需進一步研究。