白藜蘆醇誘導白念珠菌凋亡的機制探討

張 瑞，秦永亮，李 姣，郭玉楷，吳 欣，李永軍

河北醫科大學第二醫院檢驗科，河北石家莊 050000

近年來的流行病學研究表明，一些植物來源化學成分的攝入水平與腫瘤、感染的發生、發展密切相關[1]。這些成分因為具有高效、低毒的特性而備受關注。白藜蘆醇是虎杖的有效成分之一，是一種天然多酚化合物，具有廣泛的藥理活性，生物利用度較高。紅葡萄皮中有高水平的白藜蘆醇。本課題組的前期研究表明，白藜蘆醇具有一定的抗白念珠菌活性，但其作用機制不詳[2]。有研究表明，白藜蘆醇可通過誘導真菌細胞凋亡發揮抗菌作用[3]。本研究探討了白藜蘆醇通過誘導凋亡發揮抗白念珠菌活性的機制。

1 材料與方法

1.1菌株 白念珠菌ATCC 90028，由北京協和醫院惠贈。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 流式細胞儀為美國BD公司產品；恒溫培養箱為上海博迅公司產品。

1.2.2試劑 白藜蘆醇購自Sigma公司，兩性霉素B(AmB)購自Solarbio公司。PBS緩沖液pH值為7.0；RPMI-1640培養基為Solarbio公司產品；蝸牛酶為Solarbio公司產品；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒為凱基公司產品；活性氧檢測試劑盒為Solarbio公司產品；線粒體膜電位(MMP)檢測試劑盒為Solarbio公司產品。

1.3方法

1.3.1菌株的活化及菌液配制 從4 ℃保存的沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)上挑取白念珠菌ATCC 90028單菌落接種于沙氏液體培養基中，35 ℃搖床振蕩(200 r/min)過夜培養，使菌株處于對數生長期，離心收集菌體，PBS洗滌兩次后，用RPMI-1640稀釋至2×106CFU/mL備用[4]。

1.3.2菌株的凋亡誘導 將2 mL指數生長期(A600=0.5)的白念珠菌懸液(密度為2×106CFU/mL)接種于24孔培養板中，同時將白藜蘆醇分別加入孔板中，使終濃度分別為0.256、0.128、0.064 mg/mL，另設不加藥的空白對照組和加AmB(終濃度為0.5 μg/mL)的陽性對照組。37 ℃靜置孵育2 h，離心后無菌PBS洗3次，然后用Annexin Ⅴ-FITC和PI的標記液混勻(密度為106CFU/mL)。室溫避光37 ℃孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.3白藜蘆醇對白念珠菌活性氧(ROS)的影響 對指數生長期的白念珠菌懸液進行不同的加藥處理后(同1.3.2)，37 ℃孵育12 h，離心收集白念珠菌細胞，PBS緩沖液洗滌3次后調整密度為5×106CFU/mL。利用探針2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)進行ROS檢測，DCFH-DA可自由通過細胞膜進入細胞內被酯酶水解，而DCFH則不能透過細胞膜，從而使探針易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF熒光即可得知細胞內活性氧水平。按照試劑盒說明加入DCFH-DA試劑，37 ℃孵育20 min，流式細胞儀檢測白念珠菌ROS水平[5]。

1.3.4白藜蘆醇對白念珠菌MMP的影響 對指數生長期的白念珠菌懸液進行不同的加藥處理后(同1.3.2)，孵育、離心收集白念珠菌細胞、PBS緩沖液洗滌、調整濃度同1.3.3。JC-1為檢測MMP的熒光探針。當MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物產生紅色熒光；而MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，產生綠色熒光。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變(紅色和綠色熒光強度的比值)可反映細胞膜電位的變化。參照MMP檢測試劑盒說明書加入JC-1染色工作液，于細胞培養箱30 ℃避光孵育15 min后，PBS洗滌3次，用流式細胞儀檢測熒光強度[6]，然后計算。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行數據處理，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1白藜蘆醇對白念珠菌細胞凋亡的影響 在0.064～0.256 mg/mL范圍內，隨著白藜蘆醇濃度的升高，白念珠菌細胞凋亡率逐漸升高，見圖1。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.2白藜蘆醇對白念珠菌ROS陽性率的影響 空白對照組的熒光強度弱，ROS陽性率為0.8%，不同濃度白藜蘆醇(0.064、0.128、0.256 mg/mL)處理后，熒光強度呈劑量依賴性增強，ROS陽性率分別提升至1.9%、5.1%、8.7%和16.4%，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.3白藜蘆醇對白念珠菌MMP的影響 與空白對照組比較，不同濃度(0.064、0.128、0.256 mg/mL)白藜蘆醇可顯著降低白念珠菌MMP，紅色和綠色熒光強度比值分別為2.14、1.86、1.64(P<0.05)，見圖3。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

3.1白藜蘆醇誘導白念珠菌凋亡的機制 細胞凋亡是生物體普遍存在的現象——細胞自主有序的死亡過程，誘導細胞凋亡對真菌研究有重要意義。在所有誘導細胞凋亡的因素中，凋亡的早期表現之一為MMP的下降[7-8]。線粒體是真核細胞內能量產生的中心場所，對維持細胞能量代謝和正常功能起重要作用，誘發凋亡的因素會導致細胞色素C的釋放激活caspase，破壞電子傳遞，降低MMP參與調節等[9]。若MMP耗盡，細胞將進入不可逆的凋亡轉歸途徑[10]。在凋亡信號的刺激下，細胞凋亡導致一系列損傷相關的異質性分子的釋放，如線粒體DNA、ROS、n-甲?；募靶牧字?，導致細胞通透性會增加[11-12]。作為酵母菌屬細胞凋亡中的第二信使--不同水平的ROS決定了細胞的轉歸途徑，包括凋亡、壞死、凋亡轉變壞死等[13-14]。

壞死及凋亡細胞均釋放具有炎癥特性的線粒體，以往的研究表明白藜蘆醇可通過阻滯細胞S期從而影響白念珠菌的活性[15]。本實驗采用FCFH-DA和JC-1熒光試劑，檢測白念珠菌ROS和MMP水平。白藜蘆醇的作用機制可能與降低白念珠菌的MMP水平、提高ROS水平、擾亂線粒體功能等凋亡進展中與線粒體損傷有關的進程有關。

3.2白藜蘆醇誘導白念珠菌凋亡的意義 白念珠菌常存在于人類上呼吸道、口腔、腸道及陰道等黏膜腔中，是臨床上重要的條件致病菌[16-18]。臨床上的治療主要采用AmB及唑類抗真菌藥物，其長期應用引起不良反應的報道日益增多[19]，因此尋找和發現新的藥物以抑制白念珠菌的活性成為亟待解決的問題之一。白藜蘆醇作為近年中藥研究中的熱點，其廣泛的生物學活性受到關注。本研究中通過測定不同加藥處理組白念珠菌的ROS、MMP水平，證實了白藜蘆醇具有誘導白念珠菌凋亡的作用，中藥成分誘導念珠菌屬凋亡是當今抗真菌治療的新策略，為臨床治療白念珠菌感染提供了重要的實驗基礎，具有潛在的應用價值。

3.3相關研究的比較 WEBER等[20]研究證明，白藜蘆醇對于常見的念珠菌屬并未有明顯的抑制作用，而有報道指出白藜蘆醇衍生物可能影響念珠菌屬[21]。LEE等[3]的研究證實白藜蘆醇可誘導白念珠菌的凋亡。

3.4本研究的局限性 本實驗中選取白念珠菌ATCC90028的標準株作為研究對象，結果尚有代表性，但還需大樣本的臨床分離株及動物體內試驗做進一步的證實；其次，在研究方法方面除了用流式細胞儀進行檢測外，還應該結合其他分子水平的實驗來對凋亡機制進行深入分析。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過誘導細胞凋亡發揮對白念珠菌的抑制作用，為白藜蘆醇用于臨床治療白念珠菌感染提供了有效的實驗室依據，進一步豐富了中藥抗真菌的理論，但其更深入的作用機制還有待進一步研究。